病毒病对三七中皂苷生物合成的影响及三七响应病毒的分子机理

作     者：陈虹均 

作者单位：昆明理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘迪秋

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：三七 病毒病 小RNA深度测序 qPCR 皂苷生物合成 多组学联合分析 

摘      要：三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]是我国中药材中的一颗明珠,具有很高的药用价值,在云南文山州一带大规模种植。但由于三七生长周期长,且常年来遭受真菌、细菌、病毒等多种病害的胁迫,严重阻碍了三七产业的可持续发展。因而迫切需要深入研究病毒病对三七生长发育的影响以及三七响应病毒病的机理。在先前关于三七病毒病的报道中,只有少量研究运用形态学观察及血清学分析等传统手段鉴定了几种三七病毒病的病原,并没有关于三七抗病毒侵染分子机制方面研究。因此本课题采用小RNA深度测序技术(Deep sequencing of small RNAs)对云南文山州境内的具有失绿、花叶、麻点症状的感病三七进行病毒鉴定。此外,利用实时荧光定量PCR技术建立病毒的快速检测体系,以提供更为快捷准确的病毒检测手段。同时分析了病毒病对三七皂苷(P.notoginseng saponins,PNS)的生物合成以及光合作用造成的影响。最后,通过转录组测序、蛋白组及代谢组学分析研究三七与病毒的互作机制,进而为三七病毒病的防治工作提供理论基础。本论文得到的主要结果如下:1、通过对三种症状的感病三七进行s RNA深度测序,鉴定出三七A病毒(Panax notoginseng virus A,Pn VA)与人参潜隐病毒4(Panax cyrptic virus 4,PCV4),并利用RT-PCR验证了两种病毒的存在,同时在透射电子显微镜中发现了可能的球状病毒颗粒。基于人参潜隐病毒的RNA依赖的RNA聚合酶基因序列的系统发育分析,推测PCV4属于阿尔法分裂病毒(alphapartitivirus)?此外,建立了Pn VA、PCV4两种病毒的q PCR检测方法,此方法相比常规RT-PCR检测方法,具有更加准确与灵敏的优点,同时该检测方法还具有高特异性与重复性。2、在皂苷生物合成方面,失绿、花叶、麻点症状的三七中3-羟基-3-甲基戊二酰合成酶(HMCAS)与鲨烯环氧酶(SE)等关键酶的基因相对表达量与健康三七(对照)相比明显下调,几种单体皂苷的含量也降低。其中,失绿三七皂苷合成受病毒抑制作用最大,花叶三七受影响最小。在光合作用方面,三种症状的三七中二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)等光合作用相关基因的表达水平均下调,光合作用参数如叶绿素含量以及Rubisco等酶的酶活也明显降低。3、此外,基于转录组测序、蛋白质组和代谢组差异分析,初步研究了三七与病毒互作机制。转录组测序中差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、植物-病原体互作、MAPK信号途径等几条通路中;在蛋白组学分析中,卟啉和叶绿素代谢、光合作用、氧化磷酸化等途径的差异蛋白最为丰富;在代谢组学中,ABC转运蛋白、硫代葡萄糖苷生物合成以及淀粉和蔗糖代谢等通路的差异代谢物富集程度最高。基于代谢通路的多组学联合分析表明病毒侵染抑制了三七的光合作用、糖代谢等生理途径,并推测超敏反应、氧化磷酸化、水杨酸与茉莉酸信号途径参与了三七对病毒的防御反应。总之,通本论文研究的结果丰富了三七病毒病病原的鉴定方法与检测手段,更深入地认识了病毒病对三七生长发育的影响。此外,多组学联合分析初步揭示了三七与病毒互作的分子机制,有利于今后三七病毒病防治工作的开展。