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甲型流感病毒H3N2抗原进化研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2023年第6期43卷 479-484页

作者：张梦怡李岚舒黄维金赵晨燕中国食品药品检定研究院艾滋病性病病毒疫苗室北京102629

流感病毒是引起人类呼吸道感染的常见病原体。在4种季节性流感毒株中,甲型流感病毒H3N2感染已成为季节性流感疾病和死亡的主要原因,严重影响公共卫生和社会经济。自1968年首次出现并造成大流行后,H3N2一直在人群中反复流行,不断通过抗... 详细信息

流感病毒是引起人类呼吸道感染的常见病原体。在4种季节性流感毒株中,甲型流感病毒H3N2感染已成为季节性流感疾病和死亡的主要原因,严重影响公共卫生和社会经济。自1968年首次出现并造成大流行后,H3N2一直在人群中反复流行,不断通过抗原漂移来逃避宿主免疫系统的攻击,从而导致低疫苗效力。本文从甲型流感病毒H3N2的抗原进化、抗原进化对疫苗株选择的影响及一些预测流感病毒进化的模型等方面进行分析和综述,为流感病毒抗原进化分析和未来疫苗研发等工作提供参考。

关键词：流感病毒 H3N2 疫苗株抗原性预测模型

2020—2021年山东省水痘-带状疱疹病毒基因特征分析

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中华预防医学杂志 2022年第8期56卷 1080-1086页

作者：陈萌王素婷刘尧熊萍陶泽新张丽贾金丽王常银许松涛山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所济南250014 山东齐都药业有限公司山东省脑神经保护类药物重点实验室淄博255400 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 聊城市疾病预防控制中心聊城252000

目的分析2020—2021年山东省水痘-带状疱疹病毒(VZV)的基因特征。方法于2020年1月到2021年12月收集85份山东省疑似水痘患者的疱疹液样本,采用实时荧光定量PCR检测VZV核酸,筛查疑似样本。通过PCR和Sanger法测序检测阳性样本的开放阅读框(... 详细信息

目的分析2020—2021年山东省水痘-带状疱疹病毒(VZV)的基因特征。方法于2020年1月到2021年12月收集85份山东省疑似水痘患者的疱疹液样本,采用实时荧光定量PCR检测VZV核酸,筛查疑似样本。通过PCR和Sanger法测序检测阳性样本的开放阅读框(ORF)ORF22片段和ORF38片段的6个单核苷酸多态性(SNP)位点,确定病毒基因型别;检测ORF38片段和ORF62片段的4个SNP位点鉴别疫苗株和野毒株。从GenBank数据库上下载VZV各基因型参考序列,采用Sequencher软件和Mega7软件进行序列分析。结果85份疑似水痘样本中,有80份样本为VZV阳性,均为野毒株,属于clade 2遗传分支。80株序列与clade 2代表株相比,ORF22片段的核苷酸与氨基酸的同源性分别为99.5%~100%和98.5%~100%。其中病毒毒株SD20-1、SD20-5、SD20-6、SD20-8、SD20-9、SD20-10、SD20-11、SD20-12、SD20-13、SD20-30和SD20-31均在37990位点发生A?G的碱基突变,导致所编码氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸;SD21-1在38059位点发生C?A的碱基突变,导致编码苏氨酸变为天冬酰胺。结论2020—2021年山东省VZV基因型均属于clade 2型别的野毒株。

关键词：水痘-带状疱疹病毒基因型野生型毒株疫苗株

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水痘减毒活疫苗临床病例病原学分析

中国生物制品学杂志 2023年第5期36卷 589-593页

作者：权娅茹袁力勇陈震邱平李长贵中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室北京102629

目的对水痘减毒活疫苗临床病例进行病原学分析。方法采集企业水痘减毒活疫苗Ⅲ期临床试验(试验地点为河南省)中临床确诊为水痘病例的49名患者身上的水痘疱疹液,共64份,提取DNA,采用PCR和限制性片段多态性(PCR and restriction fragment ... 详细信息

目的对水痘减毒活疫苗临床病例进行病原学分析。方法采集企业水痘减毒活疫苗Ⅲ期临床试验(试验地点为河南省)中临床确诊为水痘病例的49名患者身上的水痘疱疹液,共64份,提取DNA,采用PCR和限制性片段多态性(PCR and restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)法区分野毒株和疫苗株;采用2008年国际水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)基因型命名专题会议上建议的基因分型法进行基因型分析。结果64份疱疹液均为野毒型(PstⅠ^(+)SmaⅠ^(-)BssHⅡ^(-)NaeⅠ^(-)),无疫苗相关病例发生。49份疱疹液均为Clade 2遗传支;与Clade 2遗传支相比,49份疱疹液水痘病毒基因均在SNP18082位点发生了T→C同义突变,1份在790位点发生了C→A突变。结论在河南省开展的水痘减毒活疫苗临床试验中的临床病例均为野毒株感染引起,属Clade 2遗传支。

关键词：水痘带状疱疹病毒野毒株疫苗株基因分型

云南西双版纳百日咳临床分离株与疫苗株基因和感染特征的对比研究

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云南西双版纳百日咳临床分离株与疫苗株基因和感染特征的对比研究

作者：张梦瑶云南大学

学位级别：硕士

目的分析云南西双版纳地区百日咳临床分离株的全基因组序列,获得百日咳临床分离株的主要毒力蛋白基因型,探究云南西双版纳百日咳临床分离株与国际流行的百日咳博德特氏菌、中国无细胞百日咳疫苗株(CS株)之间的同源关系。进一步比对百日... 详细信息

目的分析云南西双版纳地区百日咳临床分离株的全基因组序列,获得百日咳临床分离株的主要毒力蛋白基因型,探究云南西双版纳百日咳临床分离株与国际流行的百日咳博德特氏菌、中国无细胞百日咳疫苗株(CS株)之间的同源关系。进一步比对百日咳临床分离株和现用疫苗株感染小鼠的感染特征差异,研究现用无细胞百日咳疫苗对百日咳临床分离株产生的免疫保护效果,为筛选新的疫苗候选株提供理论依据。方法第一部分采用Nanopore测序技术对2019年至2020年从云南省西双版纳傣族自治州人民医院分离的四株百日咳博德特氏菌进行全基因组测序,利用Meg Align软件比对确定各分离株主要毒力蛋白基因型;然后和疫苗株CS株基因序列进行对比,分析百日咳临床分离株基因结构发生的变化。从数据库中筛选全球代表性的百日咳临床分离株,使用RAx ML软件构建基于全基因组SNP的系统发育树。第二部分首先利用BALB/C小鼠模型,分别用CS株和两株西双版纳百日咳临床分离株对小鼠进行气雾攻击感染;另外,使用人用剂量1/40的无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines,a PV)对BALB/C小鼠进行间隔21天的两剂次腹腔注射免疫,全程免疫后3周分别用两株百日咳临床分离株气雾攻毒。在百日咳临床分离株初始感染以及疫苗免疫后攻毒前后特定时间节点采集小鼠的血液和组织样本,检测和分析外周血白细胞数量、呼吸道和肺部百日咳杆菌定殖量以及鼻相关淋巴组织、肺中的T细胞类型和相关细胞因子水平。结果第一部分获得了四株百日咳临床分离株(BP-L1、BP-L2、BP-L3、BP-L4)的全基因组序列,四株百日咳临床分离株基因组结构与CS株相比,产生了大量的插入序列(主要是IS481)引起的基因重排。四株百日咳临床分离株的ptx P、ptx A、prn、fim3基因序列与CS株相似度在99.2%00%,BP-L1、BP-L4为ptx P3/ptx A1/prn2/fim3-1型菌株,BP-L3为ptx P1/ptx A1/prn1/fim3-1型菌株,CS株为ptx P1/ptx A2/prn1/fim3-1型菌株。系统发育树结果显示,CS株与参考株TohamaⅠ聚为一支,形成独立进化分支;近年来的全球流行的百日咳菌株分成两个大的聚类,BP-L1、BP-L4与多数欧美国家百日咳博德特氏菌聚为一支,BP-L2、BP-L3与亚洲国家和地区流行的百日咳博德特氏菌聚为一支。第二部分(1)百日咳临床分离株和CS株感染小鼠后,在鼻部的定殖能力BPL2、CS株比BP-L1强(P株比CS株的定殖能力强;(2)百日咳临床分离株清除率比CS株高,其中BP-L2在气管的清除率高于BP-L1,BP-L1在肺部的清除率高于BP-L2;(3)外周血白细胞检测显示BP-L1和BP-L2引起的炎症反应强于CS株引起的炎症反应(P株感染更强的Th1和Th17细胞免疫反应。(5)疫苗免疫后攻毒BP-L1和BP-L2菌株,小鼠气管和肺部定殖量比初始感染减少,BP-L2菌株在小鼠呼吸道和肺的定殖高于BPL1(P疫苗免疫后攻毒,小鼠外周血白细胞数量比初始感染少,BP-L2菌株诱导产生的白细胞数量大于BP-L1;(7)疫苗免疫后攻毒2周后,小鼠肺部分Th1、Th17、Th2细胞水平较高,3周后BP-L1和BP-L2还没有被完全清除。结论云南西双版纳百日咳临床分离株与疫苗株相比,主要毒力蛋白基因型和进化分支发生了明显变化,但与近年其他地区临床分离株一致。云南西双版纳百日咳临床分离株相比疫苗株,能够引起更加严重的炎症反应、组织损伤等,并诱导更强的T细胞介导的细胞免疫应答。无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后,可诱导机体产生一定程度的细胞免疫和体液免疫应答,使细菌减少定殖,但不能有效防止百日咳临床分离株的感染。本研究补充了云南边境百日咳分子流行病学研究资料,有助于为制定云南省边境百日咳的防控策略和措施提供科学依据,为新疫苗改进、开发以及筛选新的疫苗候选株提供参考依据。

关键词：百日咳博德特氏菌临床分离株疫苗株全基因组感染特征

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

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黑龙江畜牧兽医 2022年第8期 75-81页

作者：梅胜尧张玉堂张逸民孙宝海刘晶江苏省药物研究所有限公司江苏省药物安全性评价中心南京210018

为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据Gen-Bank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建... 详细信息

为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据Gen-Bank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法对2017—2020年采集于江苏省11个不同地市的505份发病犬喉拭子样品和病料样品进行检测,确定CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR的临床适用性。结果表明:该方法对CDV野毒株、CDV疫苗株、CDV野毒株/疫苗株可分别扩增出477 bp、677 bp、477 bp/677 bp的特异性条带,而检测犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV)均为阴性;该方法的检测灵敏度为23.1 pg RNA;与RFLP方法的符合率为100%;批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;利用该方法检测505份临床样品,CDV野毒株和疫苗株的阳性率分别为8.91%和72.48%。说明建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性。

关键词：犬瘟热病毒野毒株疫苗株一步法RT-PCR 检测方法应用

H7N9亚型禽流感病毒遗传进化分析及候选疫苗株初步研究

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H7N9亚型禽流感病毒遗传进化分析及候选疫苗株初步研究

作者：梁少波内蒙古农业大学

学位级别：硕士

2017年,H7N9亚型禽流感病毒由低致病性变异为高致病性病毒。同年我国使用H5+H7二价灭活疫苗(H7-Re1株),有效控制了H7N9病毒在禽间和人间的传播。2018年,H7-Re1疫苗株被H7-Re2疫苗株替代,2020年,又更新为H7-Re3疫苗株。但是,2019年以来,H... 详细信息

2017年,H7N9亚型禽流感病毒由低致病性变异为高致病性病毒。同年我国使用H5+H7二价灭活疫苗(H7-Re1株),有效控制了H7N9病毒在禽间和人间的传播。2018年,H7-Re1疫苗株被H7-Re2疫苗株替代,2020年,又更新为H7-Re3疫苗株。但是,2019年以来,H7N9病毒不断变异,在一些地区导致病例出现。疫苗作为重要防疫工具,在H7N9亚型禽流感防控中起到了至关重要的作用,但是目前H7N9病毒仍在持续进化变异中,防控的压力级难度可能未降而反增,需要持续跟踪监测并开展相关疫苗的研究储备。本研究在2020年1月至2021年4月共分离到13株H7N9亚型禽流感病毒。HA序列分析,发现13株病毒氨基酸同源性在97.2%-98.0%之间,HA存在Q226L和G186V位置的突变组合。按照单个基因片段同源性>95%作为界限划分基因型,13株H7N9病毒可分为2个基因型,其中12株属G2基因型;CK/TS0328/21株NS及NP基因与其他12株病毒核苷酸同源性位分别为93.40%-95.3%、93.0%-93.6%,遗传进化显示其NS及NP基因来自H9N2的内部基因,与其他12株病毒不同,单独占一个group。提示CK/TS0328/21株可能是H7N9与H9N2病毒内部基因重组出现新的基因型(G11)。抗原性分析结果表明,13株H7N9病毒与H7-Re3抗血清反应性较差,不同年份分离株在与相对应血清反应性上出现差异,13株H7N9病毒分为3个抗原组,其中H7-Re3疫苗株处于第Ⅰ组,虽然处于同一抗原群,但H7-Re3抗血清与其他H7N9病毒反应,HI抗体滴度相比同源毒株相差2 log2。根据抗原图谱分析,在每个抗原组挑选了1株H7N9病毒,对H7-Re3疫苗株免疫效力进行了评估,发现H7-Re3疫苗株对攻毒毒株只能提供70%～80%的致死保护。基于HI试验结果,将选取A/chicken/Shanxi/HY1027/2020作为亲本毒,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,利用反向遗传操作技术成功拯救了一株H7N9重组病毒,命名为r HY1027株。选取该株F代制备灭活疫苗进行免疫效力试验,结果显示,r HY1027灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21d免疫组HI抗体均在8 log2左右,免疫后150d HI抗体仍能达到5 log2以上。攻毒保护试验结果显示,用不同抗原群的H7N9毒株攻击,免疫组均不发病,不排毒,可对鸡形成100%保护。本研究为H7N9亚型禽流感进行有效防控工作提供基础数据和技术储备。

关键词： H7N9 禽流感病毒遗传特征抗原性反向遗传疫苗株

反向遗传技术在冷适应流感病毒疫苗株制备中的应用研究

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反向遗传技术在冷适应流感病毒疫苗株制备中的应用研究

作者：郭航炜中国食品药品检定研究院

学位级别：硕士

疫苗接种是防治流感疾病发生和流行最有效的一种手段。目前国际上广泛应用的流感疫苗包括裂解疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。与传统的灭活疫苗相比,减毒活疫苗采用冷适应流感减毒株制成,通过鼻粘膜途径免疫,具有易于大规模接种和模拟... 详细信息

疫苗接种是防治流感疾病发生和流行最有效的一种手段。目前国际上广泛应用的流感疫苗包括裂解疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。与传统的灭活疫苗相比,减毒活疫苗采用冷适应流感减毒株制成,通过鼻粘膜途径免疫,具有易于大规模接种和模拟自然感染的优点,能够全面激活体液免疫和细胞免疫应答,产生持久和交叉免疫保护,并直接诱导呼吸道黏膜免疫,分泌IgA抗体,建立起预防感染的第一道防线。此外,以流感减毒疫苗株为载体的疫苗技术,是我国新冠疫苗研发五条技术路线之一,临床研究表明对流感和新冠具有良好的双重免疫效果。因此流感减毒活疫苗在预防和控制大流行传染病方面显示出巨大的潜在应用价值。基于流感病毒的高变异特性,制备与当前流行相匹配的流感减毒活疫苗生产毒株方法包括经典重配技术和反向遗传技术,相较于WHO采用的耗时长的血清学重配方法,反向遗传技术可及时的对新病毒做出快速反应,更高效地构建抗原匹配的疫苗株,并可以对单个基因进行遗传修饰。为了建立快速构建冷适应流感减毒疫苗株的反向遗传技术平台,本研究采用8质粒反向遗传操作系统,以冷适应A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株作为骨架供体,构建了含有A/Puerto Rico/8/34(H1NI)病毒HA、NA表面抗原的冷适应流感病毒疫苗株AA-PR8,对其温度敏感性、冷适应表型、遗传稳定性和减毒特性等生物学特征进行鉴定,并在小鼠上初步评价了该疫苗株的免疫原性和保护效果。第一部分为利用反向遗传学制备冷适应流感病毒疫苗株。基于反向遗传学技术原理,分别构建俄罗斯来源的冷适应供体株A/Leningrad/134/17/57(H2N2)和美国来源的冷适应供体株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)6个骨架质粒,并分别与PR8病毒株的HA和NA抗原质粒,共同转染293T和MTY6细胞,进行病毒拯救。结果采用A/Leningrad/134/17/57(H2N2)骨架未能拯救出冷适应流感病毒疫苗株,而采用A/Ann Arbor/6/60(H2N2)骨架成功制备出了冷适应流感病毒疫苗株AA-PR8,并以此为基础成功构建出了4株2020-2022年度北半球流行的H1N1和H3N2冷适应毒株,初步建立了以A/Ann Arbor/6/60(H2N2)为骨架的冷适应流感病毒疫苗株的制备平台。第二部分对AA-PR8冷适应疫苗株进行初步评价。对AA-PR8疫苗株生物学特征进行鉴定,结果显示AA-PR8接种鸡胚后生长良好,病毒滴度可达8.10lgEID/m L;与PR8野病毒对照,AA-PR8在26℃条件下生长,在39℃条件下不能生长,具有温度敏感性及冷适应表型;连续5次传代,所有基因氨基酸位点未发生突变,具有良好的遗传稳定性;与接种同等剂量的PR8野病毒的小鼠相比,接种AA-PR8毒株的小鼠体重降幅显著减小,未发生动物死亡,第3天肺部病毒载量降低3.83 lgEID/g,未见异常炎症反应,具备减毒特性;并进一步评价了AA-PR8疫苗株在小鼠中的免疫原性及保护效果,小鼠接种一次或两次AA-PR8疫苗株均能够有效刺激小鼠体液免疫,产生IgA和IgG抗体。初免后14天采用PR8野病毒进行攻击,小鼠保护率为83.33%(5/6),体重降低幅度减少,攻毒后第3天肺脏病毒载量降低3.71 lgEID/g。二免后14天进行攻击,小鼠保护率为100%(6/6),体重基本不降低,肺脏未检测到病毒。显著降低小鼠攻击后肺脏病毒载量,提高生存率,具有较好的免疫保护作用。综上,本研究以A/Ann Arbor/6/60(H2N2)冷适应减毒株为骨架,通过反向遗传学技术成功构建了含有PR8病毒HA和NA表面抗原的AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株。该疫苗株产量高,具有温度敏感性和冷适应表型,遗传稳定性良好,在小鼠模型上表现出明显的减毒特性。能够有效刺激小鼠产生较高滴度的IgA和IgG抗体,显示较好的免疫原性和保护效果。

关键词：反向遗传学减毒活疫苗流感病毒疫苗株冷适应

高增殖猪流感重组病毒GX1659/PR8的制备与鉴定

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中国预防兽医学报 2021年第10期43卷 1103-1107页

作者：宋祖晨孟飞张丹丹王飞飞刘雅茹陈艳乔传玲陈化兰杨焕良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为构建一株具有高复制能力的流感病毒疫苗株,本研究利用反向遗传技术以PR8的6个内部基因为骨架,以一株H3N2亚型低致病力猪流感病毒(SIV)GX1659株的HA和NA表面基因为供体,构建了pBD-GX1659-HA和pBD-GX1659-NA重组质粒,转染293T细胞并接种... 详细信息

为构建一株具有高复制能力的流感病毒疫苗株,本研究利用反向遗传技术以PR8的6个内部基因为骨架,以一株H3N2亚型低致病力猪流感病毒(SIV)GX1659株的HA和NA表面基因为供体,构建了pBD-GX1659-HA和pBD-GX1659-NA重组质粒,转染293T细胞并接种SPF胚,经血凝试验、测序筛选获得了一株重组病毒GX1659/PR8。该重组病毒在鸡胚传20代,血凝价均能达到8 log2以上。每5代病毒的全基因组经PCR和测序鉴定,结果显示,PCR产物均无任何缺失或突变,表明GX1659/PR8具有遗传稳定性。分别利用100 EID_(50)剂量的GX1659和GX1659/PR8感染鸡胚,在不同时间测定鸡胚尿囊液的血凝效价和EID_(50),绘制其生长曲线。结果显示,GX1659和GX1659/PR8分别在接种后60 h和48 h时血凝效价达到峰值,GX1659/PR8效价滴度明显高于亲本病毒GX1659。利用亲本病毒GX1659与重组病毒GX1659/PR8的抗原和阳性血清进行交叉HI试验,测定HI效价及交叉HI效价并对抗原性进行分析。结果显示,亲本病毒GX1659与重组病毒GX1659/PR8抗原性无明显差异。本研究拯救出一株具有稳定遗传性和高增殖性能的H3亚型重组病毒GX1659/PR8,为H3N2亚型流感病毒疫苗株的构建奠定了重要基础。

关键词： H3N2流感病毒 PR8 反向遗传技术生物学特性疫苗株

我国黄热病疫苗株(天坛株)与WHO疫苗株17D-213的安全性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第9期39卷 657-661页

作者：王玲李娜房恩岳殷乐李玉华中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室北京102629 北京生物制品研究所有限责任公司质量检定室 100176

目的研究我国黄热病疫苗株天坛株与WHO疫苗株17D-213在小鼠体内的脑内致病力。方法将同等病毒量的天坛株与17D-213株脑内注射不同年龄、不同品系的小鼠,观察并记录小鼠生存情况,分析两毒株的LD50/ml以及半数生存期。结果同等病毒量的天... 详细信息

目的研究我国黄热病疫苗株天坛株与WHO疫苗株17D-213在小鼠体内的脑内致病力。方法将同等病毒量的天坛株与17D-213株脑内注射不同年龄、不同品系的小鼠,观察并记录小鼠生存情况,分析两毒株的LD50/ml以及半数生存期。结果同等病毒量的天坛株与17D-213株对1日龄乳鼠、7~9 g小鼠、12~14 g小鼠的半数致死量(LD50)/ml均无差异,对7~9 g小鼠与12~14 g小鼠的生存趋势差异也无统计学意义。两病毒株对1日龄乳鼠的生存趋势存在一定的统计学差异,但是天坛株的半数生存期为11 d,WHO疫苗株17D-213为6 d。同等病毒量的两毒株,对BALB/c、KM、ICR、C57四个品系小鼠的LD50/ml也均无差异,仅对NIH小鼠表现出有一定的差异。结论我国黄热病疫苗株天坛株与WHO疫苗株17D-213对不同年龄、不同品系小鼠的脑内致病力无明显差异,安全性良好。

关键词：黄热病疫苗株脑内致病力安全性研究