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疏水性电荷诱导层析——原理、性能及其应用

化工进展 2010年第10期29卷 1951-1956页

作者：夏海锋林东强姚善泾江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

介绍了疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)的原理及特点:其功能基团结合了疏水作用和静电相互作用,是一种混合型的双模式层析方法。由于HCIC在蛋白质(特别是抗体)的分离纯化中表现出操作简便、选择... 详细信息

介绍了疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)的原理及特点:其功能基团结合了疏水作用和静电相互作用,是一种混合型的双模式层析方法。由于HCIC在蛋白质(特别是抗体)的分离纯化中表现出操作简便、选择性较好等优点,受到了学术界和工业界的关注。对HCIC的技术原理、发展历程、层析行为以及应用现状等进行综述,以期对HCIC的深入研究和应用开发提供指导。

关键词：生物分离疏水性电荷诱导层析混合模式吸附功能配基

疏水性电荷诱导层析分离抗HER2和抗IL-12/23单克隆抗体研究

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疏水性电荷诱导层析分离抗HER2和抗IL-12/23单克隆抗体研究

作者：李菁浙江大学

学位级别：硕士

单克隆抗体(单抗)作为重要的生物技术药物,具有巨大的市场需求和开发潜力,传统的蛋白A亲和层析分离存在一些不足,因此开发经济高效的单抗分离新方法和新介质具有十分重要的意义。疏水性电荷诱导层析(HCIC)作为近年来发展迅速的抗体分离... 详细信息

单克隆抗体(单抗)作为重要的生物技术药物,具有巨大的市场需求和开发潜力,传统的蛋白A亲和层析分离存在一些不足,因此开发经济高效的单抗分离新方法和新介质具有十分重要的意义。疏水性电荷诱导层析(HCIC)作为近年来发展迅速的抗体分离新方法,具有一定优势,但分离工艺和配基结构有待进一步优化。本论文选择两种典型的单抗药物,抗HER2单抗和抗IL-12.23单抗,探讨HCIC从CHO细胞培养上清液中分离单抗,考察吸附性能,优化分离条件,比较分析商业化介质和本课题组开发的新型HCIC介质,为单抗规模化分离纯化提供了新思路。首先,将典型的HCIC介质MEP HyperCel应用于CHO细胞培养上清液中抗HER2单抗的分离。考察了细胞培养液上清液的特性,发现温度和pH对单抗稳定性有一定影响。考察了MEP HyperCel介质对抗HER2单抗的吸附性能,发现中性pH时吸附容量较高,酸性pH时吸附容量显著下降。考察了抗HER2单抗的动态载量,优化了分离工艺,确定了合适的上样和洗脱条件,实现了细胞培养液中抗HER2单抗的高效分离,纯度达到94.6%,得率约0.1mg/(ml料液)。其次,采用本课题组设计和制备的HCIC介质ABI,以氨基苯并咪唑为功能配基,从CHO细胞培养上清液中分离抗白介素12.23单抗(抗IL-12.23单抗),并与MEP HyperCel介质比较。结果表明,ABI介质对单抗的吸附性能良好,静态吸附容量略低于MEP HyperCel介质,但动态载量较高,受流速影响小,适合于高流速操作。优化了单抗分离工艺,包括上样和洗脱过程,确定了合适的分离条件,实现了细胞培养液中高效分离单抗,pH3.6条件下洗脱单抗纯度达到98.6%,收率为93.0%,明显优于MEP HyperCel介质。最后,采用本课题组设计、具有双功能配基色氨酸-氨基苯并咪唑的新型HCIC介质W-ABI,从CHO细胞培养上清液中分离抗IL-12.23单抗。结果表明,pn对W-ABI介质吸附单抗影响显著,中性pH范围内吸附容量较高,酸性pH条件下可以通过静电排斥作用实现解吸。W-ABI介质的动态载量受流速影响较小,高流速条件下仍保持较高的载量,性能优于MEP HyperCel介质。优化洗脱pH后,单抗纯度达97.2%,收率达93.3%,收率高于蛋白A亲和层析,洗脱组分中宿主细胞残留量(HCP)明显低于MEP HyperCel分离,显示出良好的应用前景。本论文围绕哺乳动物细胞培养液中高效分离单抗,从提高HCIC分离抗体的效率出发,对分离工艺进行了优化,探讨了两种新型HCIC介质的分离性能,分析了不同介质的分离效果,显示了新介质的应用潜力,证实了HCIC分离单抗的可行性,为单抗分离新方法和新介质的进一步开发和应用打下了基础。

关键词：生物分离单克隆抗体疏水性电荷诱导层析过程优化

疏水性电荷诱导层析磁性微球分离鸡蛋卵清白蛋白

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湖州师范学院学报 2019年第10期41卷 48-51页

作者：吴立群沈超怡姚晓丹张慧敏顾佳黎湖州师范学院生命科学学院

利用疏水性电荷诱导层析磁性微球从鸡蛋中分离卵清白蛋白,优化卵清白蛋白的分离工艺.辛酸预处理pH为5.8,辛酸加入量为50μL/mL蛋清处理液,磁性微球吸附pH为5.8,洗脱pH为3.8,洗脱时加入NaCl,其浓度为1 mol/L,卵清白蛋白的回收率约为78%,... 详细信息

利用疏水性电荷诱导层析磁性微球从鸡蛋中分离卵清白蛋白,优化卵清白蛋白的分离工艺.辛酸预处理pH为5.8,辛酸加入量为50μL/mL蛋清处理液,磁性微球吸附pH为5.8,洗脱pH为3.8,洗脱时加入NaCl,其浓度为1 mol/L,卵清白蛋白的回收率约为78%,表明疏水性电荷诱导层析磁性微球可以有效分离卵清白蛋白.

关键词：疏水性电荷诱导层析卵清白蛋白鸡蛋

基于氨基苯并咪唑配基的疏水性电荷诱导层析介质制备和蛋白吸附研究

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基于氨基苯并咪唑配基的疏水性电荷诱导层析介质制备和蛋白吸附研...

作者：王存响浙江大学

学位级别：硕士

疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge-induction chromatography, HCIC)是一种新型抗体分离方法,其功能配基兼有疏水和静电相互作用,中性条件下利用疏水作用吸附目标蛋白,调节pH改变配基的荷电特性,依靠静电排斥作用协助蛋白洗脱。目... 详细信息

疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge-induction chromatography, HCIC)是一种新型抗体分离方法,其功能配基兼有疏水和静电相互作用,中性条件下利用疏水作用吸附目标蛋白,调节pH改变配基的荷电特性,依靠静电排斥作用协助蛋白洗脱。目前,HCIC介质的蛋白吸附性能有待提高。本论文以抗体分离为目标,以5-氨基苯并咪唑(5-aminobenzimidazole,ABI)为功能配基,比较三种配基偶联方式,制备不同配基密度的系列介质,考察配基密度和偶联方式对蛋白吸附的影响,以指导新型介质设计。主要结果如下：首先,以琼脂糖凝胶为基质,优化ABI配基偶联,制备了不同配基密度的ABI-B-6FF介质。以人免疫球蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,考察了静态吸附、吸附动力学和蛋白穿透行为,发现随着配基密度的增大,蛋白饱和吸附容量和有效扩散系数逐步增大,并趋于饱和;高配基密度介质具有更高的动态载量,且随流速影响小;hIgG吸附量高于BSA,随着配基密度增大,hIgG的吸附选择性有所提高;引入孔表面配基密度,发现与饱和吸附容量、有效扩散系数和动态载量呈线性相关。其次,以葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶为基质,制备了不同配基密度的ABI-B-XL介质。以hIgG为模型蛋白,考察了pH、添加盐和配基密度对蛋白吸附的影响。发现pH影响显著,7.0～8.5之间吸附容量较高;添加盐对蛋白吸附影响不大,体现出较好的耐盐吸附特性;随配基密度增大,蛋白吸附容量、有效扩散系数和动态载量均呈现先增大后降低的趋势,最优配基密度为220 μmol/g,100cm/h线性流速下hIgG的动态载量达66.70 mg/g。结果表明,葡聚糖接枝ABI-B-XL介质比未接枝的ABI-B-6FF介质,抗体吸附性能显著提高。最后,以琼脂糖凝胶为基质,以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为接枝单体,采用原位聚合方法,通过控制GMA和配基添加量,制备了系列G-ABI-4FF介质,配基密度显著高于葡聚糖接枝介质。考察了配基密度对介质吸附hIgG的影响,发现随配基密度增大,蛋白吸附容量、有效扩散系数和动态载量均呈现先增大后降低的趋势,最优配基密度为330 μmol/g,100 cm/h线性流速下hIgG的动态载量高达82.10 mg/g,且随流速变化小。相比葡聚糖接枝介质,GMA接枝介质的抗体吸附性能进一步得到改善。本文围绕新型HCIC介质制备,系统考察了配基偶联方式和配基密度对抗体吸附的影响,发现孔内接枝可以有效提高吸附容量、促进孔内传质、改善动态载量,特别是原位聚合的GMA接枝介质,配基密度显著提高,配基分布更加均匀,有效改善了HCIC介质的动态结合性能,显示出良好的抗体分离应用前景。

关键词：疏水性电荷诱导层析接枝型层析介质配基密度蛋白吸附人免疫球蛋白牛血清白蛋白

4-巯乙基吡啶配基与IgG相互作用的分子模拟研究

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化学学报 2010年第16期68卷 1597-1602页

作者：王红寅林东强姚善泾贠军贤姚克俭化学工程联合国家重点实验室浙江大学化学工程与生物工程学系杭州310027 绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地浙江工业大学杭州310032

4-巯乙基吡啶(MEP)是一种新型的疏水性电荷诱导层析(HCIC)配基,具有良好的抗体分离性能,采用分子模拟方法研究MEP配基与IgG间的分子相互作用,以探讨HCIC分离机制.先通过分子对接搜索IgG分子Fc片段A链的蛋白表面,确定12个可能与MEP结合... 详细信息

4-巯乙基吡啶(MEP)是一种新型的疏水性电荷诱导层析(HCIC)配基,具有良好的抗体分离性能,采用分子模拟方法研究MEP配基与IgG间的分子相互作用,以探讨HCIC分离机制.先通过分子对接搜索IgG分子Fc片段A链的蛋白表面,确定12个可能与MEP结合的位点区域,然后用分子动力学模拟考察了其中6个位点的结合性能.结果表明,MEP在Fc-A链表面的结合具有疏水倾向性,pH中性条件下,MEP能稳定地结合在TYR319和LEU309附近的位点,并与两者形成氢键作用,该区域具有疏水性极强的口袋结构;其他位点的结合较不稳定,受MEP取向影响大.在pH4.0酸性条件下,原先稳定结合的MEP快速从Fc-A链表面脱离,主要原因是MEP和Fc间的静电排斥作用,以及疏水作用减弱和氢键结合的消失.通过分子模拟方法,从分子水平验证了HCIC独特的作用机理:疏水相互作用主导吸附,静电排斥作用协助解吸.

关键词： 4-巯乙基吡啶 IgG 疏水性电荷诱导层析结合模式分子模拟

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一种新的生物分离方法——混合模式吸附层析

化工学报 2007年第9期58卷 2169-2177页

作者：姚善泾高栋林东强浙江大学化学工程与生物工程学系浙江杭州310027

混合模式吸附层析是一种新型的生物分离方法,其功能配基兼有两种或两种以上的作用模式,主要为静电和疏水相互作用。在低盐和高盐条件下,都可以实现对目标物的有效吸附,具有明显的耐盐吸附的特性,可避免对料液的额外预处理,从而提高分离... 详细信息

混合模式吸附层析是一种新型的生物分离方法,其功能配基兼有两种或两种以上的作用模式,主要为静电和疏水相互作用。在低盐和高盐条件下,都可以实现对目标物的有效吸附,具有明显的耐盐吸附的特性,可避免对料液的额外预处理,从而提高分离效率,减少分离成本,已获得一定的应用。本文对混合模式吸附技术的发展历程、类型及应用现状等进行综述,以推动该技术的发展和进一步应用。

关键词：生物分离层析混合模式耐盐吸附疏水性电荷诱导层析配基结构

离子液体复合溶剂法制备纤维素微球及其应用研究

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离子液体复合溶剂法制备纤维素微球及其应用研究

作者：王鹏浙江大学

学位级别：硕士

层析广泛应用于各类生化物质,特别是生物大分子的分离纯化,具有条件温和、分离效率高、选择性好等优点。层析介质是影响层析分离效果的关键因素,性能优良的层析介质开发—直是该领域的重点。本文采用微晶纤维素为原料,考察离子液体复合... 详细信息

层析广泛应用于各类生化物质,特别是生物大分子的分离纯化,具有条件温和、分离效率高、选择性好等优点。层析介质是影响层析分离效果的关键因素,性能优良的层析介质开发—直是该领域的重点。本文采用微晶纤维素为原料,考察离子液体复合溶剂对纤维素的溶解性能,以复合溶剂直接溶解纤维素,采用反相悬浮再生法制备纤维素多孔微球,表征微球各项性能,最后偶联功能配基,考察介质对蛋白质的吸附性能。具体包括以下几个方面：1.采用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(BmimCl)和1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)复合溶剂直接溶解微晶纤维素,考察了复合溶剂配比和温度等对纤维素溶解度、溶解时间和溶液黏度的影响,优化了纤维素黏胶制备方法。通过比较原料微晶纤维素、BmimCl溶解再生的纤维素和复合溶剂溶解再生的纤维素三者的聚合度、红外光谱、X射线衍射和热重分析结果,探讨复合溶剂溶解纤维素的机理。2.以复合溶剂溶解微晶纤维素得到四种纤维素黏胶,采用反相悬浮再生法,制备了四种纤维素微球,Cell-1、Cell-2、Cell-3、Cell-4。对四种微球进行表征,包括湿真密度、含水率、孔容、孔度、比表面积、平均孔径、孔径分布、粒径分布、外观形态等。选定择球形度好、比表面积大、孔道分布合适的Cell-1微球作为后续层析介质制备的基质材料。3.以Cell-1微球为基质材料,分别偶联阴离子交换配基和疏水性电荷诱导配基,得到离子交换容量达到450μmol/mL的阴离子交换介质Cell-DEAE和配基密度为813μmol/mL的疏水性电荷诱导层析介质Cell-AB-MMI。分别以BSA和IgY作为吸附蛋白,考察了两种介质对蛋白质的静态吸附平衡和吸附动力学。结果表明,两种介质具有较高的饱和吸附容量,与蛋白质的相互作用力也较强,具有作为蛋白质分离用层析介质的良好潜力。

关键词：层析纤维素微球离子液体复合溶剂离子交换层析疏水性电荷诱导层析

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混合模式层析及其用于卵黄抗体分离纯化研究

混合模式层析及其用于卵黄抗体分离纯化研究

作者：何瑜芳浙江大学

学位级别：硕士

混合模式吸附层析技术(Mixed-mode adsorption chromatography)是近年来发展的一种新型生化分离技术。混合模式吸附剂的功能配基同时含有疏水基团和离子交换基团，兼具疏水作用和静电相互作用，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来... 详细信息

混合模式吸附层析技术(Mixed-mode adsorption chromatography)是近年来发展的一种新型生化分离技术。混合模式吸附剂的功能配基同时含有疏水基团和离子交换基团，兼具疏水作用和静电相互作用，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸。另外，配基密度通常比较高，具有典型的耐盐吸附特性，可以不需要调节原料液的离子强度直接层析分离，减少分离步骤，提高分离效率。本文重点研究了两种混合模式吸附剂—Streamline Direct HST和MEP HyperCel，考察了模型蛋白的吸附规律和影响因素，探讨了相关的吸附机理，并将混合模式吸附层析应用于卵黄抗体的分离纯化，达到了较好的分离效果。主要内容可分为以下四个方面：(1)Streamline Direct HST对模型蛋白的静态吸附。以牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白为模型蛋白，考察pH和盐浓度对Streamline Direct HST吸附蛋白质的影响。结果表明，Streamline Direct HST对蛋白质的吸附随pH的变化而变化，存在最适pH使得吸附容量最大，蛋白质分子体积的变化在一定程度上会影响吸附容量。当蛋白质与吸附剂存在静电吸引作用时，吸附过程由静电相互作用主导，吸附等温线符合Langmuir吸附方程;当存在静电排斥作用时，吸附等温线则呈现典型的多分子层吸附模式。(2)Streamline Direct HST分离卵黄抗体。结果表明，在pH4-6范围内Streamline Direct HST对卵黄稀释液中大多数蛋白质都有较强的吸附能力，盐浓度对卵黄抗体吸附的影响很小，改变pH可以实现蛋白质洗脱。由于Streamline Direct HST对卵黄抗体的选择性不高，通过改变上样pH和洗脱条件难以实现卵黄抗体的有效分离。(3)MEP HyperCel对模型蛋白的静态吸附。以溶菌酶和BSA为模型蛋白，HCIC吸附剂MEP HyperCel对蛋白质的吸附呈现复杂的规律。MEP HyperCel在pH 6-12间对溶菌酶都有吸附，吸附容量随着pH的增加而增加。结果表明，pH是影响MEP HyperCel吸附蛋白质的主要因素。MEP HyperCel对蛋白质吸附能力强，可能造成洗脱困难，实验中无法实现MEP HyperCel对血红蛋白的有效洗脱。(4)MEP HyperCel分离卵黄抗体。结果表明MEP HyperCel对卵黄抗体具有良好的吸附选择性。通过分离条件的优化，MEP HyperCel一步分离卵黄抗体纯度达到95％以上。MEP HyperCel吸附具有耐盐特性，因此可以与盐析过程相结合，盐析沉淀重新溶解后直接MEP HyperCel层析分离，电泳分析IgY纯度可达到99.8％，实现了卵黄抗体的高效分离。通过本文研究，揭示了典型混合模式吸附剂吸附蛋白质的一些规律，为开发新型混合模式吸附剂和分离过程优化提供了有益的指导。采用疏水性电荷诱导层析介质MEP HyperCel，实现了卵黄抗体分离的高效分离，单步纯化因子高，为进一步抗体分离的应用打下了一定基础。

关键词：混合模式吸附疏水性电荷诱导层析卵黄抗体耐盐吸附牛血清白蛋白牛血红蛋白溶菌酶

BLI传感技术在疾病诊断和抗体纯化工艺的应用

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BLI传感技术在疾病诊断和抗体纯化工艺的应用

作者：王卓霄大连理工大学

学位级别：硕士

生物膜干涉(Biolayer interferometry, BLI)技术是一种基于光干涉现象的无标记生物传感技术。入射光在传感器表面生物膜两端的反射光形成的干涉光谱随着生物膜有效厚度的变化发生漂移,通过监测干涉光谱的变化,可以反映出传感器表面生物... 详细信息

生物膜干涉(Biolayer interferometry, BLI)技术是一种基于光干涉现象的无标记生物传感技术。入射光在传感器表面生物膜两端的反射光形成的干涉光谱随着生物膜有效厚度的变化发生漂移,通过监测干涉光谱的变化,可以反映出传感器表面生物分子吸附量的变化。由于其灵敏度高,样品需求量少和快速定量的特性,近年来BLI技术在生物大分子相互作用方面取得了越来越多的应用。本文利用BLI技术,在疾病诊断和抗体纯化工艺方面开展了以下研究：(1)以二乙烯基砜(DVS)作为偶联剂,将天然氨基酸键合在传感器探头表面,制备了一类新型抗垢涂层;在含有抗垢涂层的传感器表面固定森林脑炎重组抗原,对森林脑炎患者血清进行检测。通过蛋白吸附实验对抗垢涂层的氨基酸进行了筛选,并结合接触角的变化对键合条件进行了优化。结果表明,使用赖氨酸(50 mM)在pH 9.5的条件下制备的抗垢涂层具有最优的抗蛋白非特异性吸附能力。对森林脑炎患者血清的检测结果与临床ELISA检测结果相吻合,表明文中建立的传感器表面抗垢涂层制备方法可以应用于血清等生化复杂样品的快速定量检测。(2)以DVG为偶联剂,将疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic Charge-Induction Chromatography, HCIC)配基固定于BLI传感器探头表面,初步探索了一种对层析配基快速评价和抗体纯化工艺优化的方法。以HCIC配基4-巯乙基吡啶(MEP)为例,采用BLI传感器对多物种抗体蛋白和白蛋白进行吸附实验,并结合蛋白A结果,验证了采用BLI传感器评价抗体层析配基的可行性。并将该方法应用于其他配基,对其性能进行了评价。证明采用BLI传感器能够实时监测蛋白在配基表面的吸附/解离过程,该方法可以评价配基性能和抗体纯化工艺,在抗体层析工艺方面有着潜在的应用和推广价值。此外,本论文还开展了人工金属酶催化不对称氢转移反应的初步探索。文中构建了基于链霉亲和素-生物素体系的人工金属酶：以对甲基苯磺酰氯、生物素为原料,合成了生物素化金属钌配合物;在不含链霉亲和素的情况下,以苯乙酮不对称氢转移反应为例,对反应时间、底物/催化剂比、pH、甲酸浓度等因素进行了优化;采用链霉亲和素-生物素体系考察上述催化反应,初步研究了催化反应的产率和立体选择性。结果表明构筑的人工金属酶催化剂具有较好的手性选择性(ee42.5%),验证了该人工金属酶体系的有效性。

关键词：生物膜干涉疾病监测疏水性电荷诱导层析不对称氢转移人工金属酶