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细胞膜力学性能对电穿孔影响的仿真研究

电工技术学报 2022年第17期37卷 4326-4334,4400页

作者：米彦吴晓徐进郑伟马驰输配电装备及系统安全与新技术国家重点实验室(重庆大学) 重庆400030

为探究细胞膜的力学性能对电穿孔的影响,该文将细胞膜视为一种超弹性材料,在COMSOL中建立细胞膜上局部单个微孔的机电耦合模型,分析细胞膜弹性应变能对微孔形成的影响,并比较了细胞膜弹性模量不同时微孔形成过程的差异。结果表明,细胞... 详细信息

为探究细胞膜的力学性能对电穿孔的影响,该文将细胞膜视为一种超弹性材料,在COMSOL中建立细胞膜上局部单个微孔的机电耦合模型,分析细胞膜弹性应变能对微孔形成的影响,并比较了细胞膜弹性模量不同时微孔形成过程的差异。结果表明,细胞膜的应变能一方面增大了从疏水孔向亲水孔转变时的越过能垒,并且膜弹性模量越大,越过能垒越大,且二者线性相关;另一方面,应变能的增加使微孔稳定,阻止微孔无限扩大,稳定尺寸与细胞膜力学性能和跨膜电位有关。该文通过仿真揭示了细胞膜的力学性能在电穿孔中的重要作用,并为研究细胞结构对电穿孔的影响机制提供了理论参考。

关键词：力学性能电穿孔机电耦合应变能微孔能量

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电穿孔法可用于家蚕基因功能分析

昆虫学报 2021年第7期64卷 809-816页

作者：周文林藤原晴彦上村望叶爱红武雪会陈学东张婷婷曹锦如浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所杭州310021 东京大学大学院新领域创成科学研究科先端生命科学专攻日本千叶县柏市277-8562

【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1(Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ER... 详细信息

【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1(Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control,NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。

关键词：家蚕电穿孔转基因 Wnt1 RNAi 基因功能

纳秒脉冲作用下核孔复合体影响细胞核膜电穿孔变化的仿真研究

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电工技术学报 2021年第18期36卷 3821-3828页

作者：程显陈硕吕彦鹏葛国伟连昊宇郑州大学电气工程学院郑州450001 河南省输配电装备与电气绝缘工程研究中心郑州450001

纳秒脉冲电场能够透过细胞膜,靶向作用到细胞核膜产生电穿孔,从而诱导细胞死亡。而细胞核膜上存在的大量具有高电导率的核孔复合体(NPC)将会制约细胞核膜上电穿孔的发展。然而,现有纳秒脉冲电穿孔的仿真研究中尚未考虑此因素的影响。基... 详细信息

纳秒脉冲电场能够透过细胞膜,靶向作用到细胞核膜产生电穿孔,从而诱导细胞死亡。而细胞核膜上存在的大量具有高电导率的核孔复合体(NPC)将会制约细胞核膜上电穿孔的发展。然而,现有纳秒脉冲电穿孔的仿真研究中尚未考虑此因素的影响。基于此,该文建立考虑细胞核上NPC存在的五层细胞介电模型,在细胞核膜不同区域等距离设置8个核孔进行仿真研究。通过COMSOL软件的电流模块和偏微分计算分析模块,首次研究NPC对细胞核电穿孔程度的影响。结果表明,与无核孔时的细胞核电穿孔状态相比,NPC的存在会导致附近一定区域内的核膜上电穿孔程度显著性下降,甚至会转变为未电穿孔状态,NPC附近核膜电穿孔衰减程度也与NPC的位置相关;随着NPC数量的增加(2~32个),细胞核膜上电穿孔明显衰减的区域也逐渐增加,当NPC个数达到32个时,细胞核膜上电穿孔程度发生衰减的区域百分比已达到89.93%,衰减50%以上的区域百分比为36.00%,衰减90%以上的区域百分比可达到22.94%,而因NPC存在导致周围区域由穿孔状态变为未穿孔状态的百分比也达到2.54%。上述研究表明,NPC的存在会极大地降低周围细胞核电穿孔效应及整体细胞核电穿孔的程度,从而显著影响纳秒脉冲杀伤肿瘤细胞的效果。因此,在对靶向诱导细胞核膜电穿孔的纳秒脉冲电场参数选择时,应考虑NPC的影响。

关键词：有限元电穿孔核孔复合体介电模型跨膜电位孔密度

PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

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畜牧兽医学报 2023年第6期54卷 2330-2342页

作者：王辉许梦缘刘灵康郑喜邦李恭贺吴文德广西大学动物科学技术学院南宁530004

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在... 详细信息

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白,利用SUMO酶切除SUMO-His标签,获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后,先将带有attP TT-DsRed2-attP CT片段的“着陆点”(landing pad,LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞,然后进行第二次电穿孔,将带有attB TT-EGFP-HiBiT-attB CT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞,验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导,该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白,经亲和层析纯化,SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-His标签的天然PhiC31蛋白均成功触发了pBCPB+质粒attP和attB位点之间的重组反应,重组效率基本一致(50%vs.52%);以脂质体转染法将PhiC31真核表达质粒pCMVInt与LP质粒和donor质粒共转染DF-1细胞,荧光显微镜观察证实了DsRed2-EGFP置换现象;以电穿孔方式将LP质粒、donor质粒和PhiC31蛋白先后导入DF-1细胞,获得了相同结果,表明PhiC31蛋白引发了attP TT与attB TT、attP CT与attB CT之间的重组反应。通过原核表达获得的PhiC31蛋白具有生物活性,有望成为一种重要试剂而用于Easi-CRISPR-TARGATT介导的转基因鸡研究。

关键词： PhiC31整合酶原核表达电穿孔 RMCE DF-1细胞鸡

纳秒电脉冲对肝脏组织不可逆电穿孔消融区分布的时域有限差分法仿真

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电工技术学报 2021年第18期36卷 3841-3850页

作者：胡亚楠包家立朱金俊朱朝阳岑泽南浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点实验室生物物理与医学工程研究组杭州310058

纳秒电脉冲消融是一种新型的电外科手术技术,在肿瘤切除中可以无创或少创器官旁组织,尤其是血管,达到既切除肿瘤,又不伤及周边组织的目的。纳秒电脉冲参数,如脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲数、脉冲率等的选择是术前治疗计划设计的关键,... 详细信息

纳秒电脉冲消融是一种新型的电外科手术技术,在肿瘤切除中可以无创或少创器官旁组织,尤其是血管,达到既切除肿瘤,又不伤及周边组织的目的。纳秒电脉冲参数,如脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲数、脉冲率等的选择是术前治疗计划设计的关键,术前进行仿真研究对手术设计至关重要。以人体模型Duke为对象,采用人体生物电磁仿真软件平台Sim4Life中的时域有限差分法(FDTD),对电脉冲波形、脉冲电压和电极间距在肝组织中的电场、能量密度、消融区域进行仿真。结果显示,在肝组织及旁组织中,电极中心电场强度较高,周边较低;脉冲波型对肝组织中电场和能量密度分布没有显著改变;消融区域包裹着电极;脉冲波型对消融区域没有变化,但脉冲电压和电极间距对消融区域有很大影响。因此,FDTD可以术前对电脉冲治疗计划设计,脉冲电压和电极间距两个参数是主要设计参数,Sim4Life是治疗计划设计的良好平台。

关键词：电穿孔不可逆电穿孔纳秒刀仿真时域有限差分法

微/纳秒脉冲电场靶向不同尺寸肿瘤细胞内外膜电穿孔效应研究

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电工技术学报 2020年第1期35卷 115-124页

作者：姚陈果宁郡怡刘红梅郑爽董守龙输配电装备及系统安全与新技术国家重点实验室(重庆大学)

为深入研究细胞物理特性对微/纳秒脉冲电场诱导的电穿孔效应差异,以三种不同细胞大小及两种不同细胞核大小的肿瘤细胞为研究对象,基于其细胞几何特征建立1:1五层介电及电穿孔数值模型,并观察其在微/纳秒脉冲电场作用下细胞内外膜的荧光... 详细信息

为深入研究细胞物理特性对微/纳秒脉冲电场诱导的电穿孔效应差异,以三种不同细胞大小及两种不同细胞核大小的肿瘤细胞为研究对象,基于其细胞几何特征建立1:1五层介电及电穿孔数值模型,并观察其在微/纳秒脉冲电场作用下细胞内外膜的荧光消散情况,对微/纳秒脉冲电场诱导细胞内外膜电穿孔效应进行对比分析,研究微/纳秒脉冲电场靶向作用于不同几何尺寸细胞的敏感性差异机理。结果表明,在90个脉冲宽度为100μs、电场强度为1.5kV/cm的微秒脉冲作用下,细胞尺寸越大,细胞外膜穿孔区域、孔密度和荧光消散程度也越大,即诱导的细胞膜电穿孔效果更强。在80个脉冲宽度为400ns、电场强度为15kV/cm的纳秒脉冲作用下,细胞核尺寸越大,其细胞核膜的穿孔区域、孔密度和荧光消散程度也越大,即诱导的细胞核膜电穿孔效果更强。因此,微/纳秒脉冲电场对肿瘤细胞的作用靶区及尺寸大小具有明显的选择性。该研究可为消融不同肿瘤所需的脉冲电场参数提供数据参考与理论支撑。

关键词：脉冲电场电穿孔荧光探针细胞尺寸选择性

不可逆电穿孔消融在肝恶性肿瘤局部治疗中的应用

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中华肝胆外科杂志 2022年第2期28卷 81-84页

作者：王浩陈光高海军伊正甲沈文天津医科大学一中心临床学院天津300192 天津市第一中心医院放射科天津300192

目的探讨不可逆电穿孔消融在肝恶性肿瘤局部治疗中的应用效果和安全性。方法回顾性分析2018年9月至2019年8月天津市第一中心医院因肝恶性肿瘤接受不可逆电穿孔消融治疗的21例患者的临床资料,其中男性17例,女性4例,中位年龄57.9(48,69)... 详细信息

目的探讨不可逆电穿孔消融在肝恶性肿瘤局部治疗中的应用效果和安全性。方法回顾性分析2018年9月至2019年8月天津市第一中心医院因肝恶性肿瘤接受不可逆电穿孔消融治疗的21例患者的临床资料,其中男性17例,女性4例,中位年龄57.9(48,69)岁。根据Clavien-Dindo并发症分级系统对并发症进行分级。以改良实体瘤疗效评价标准评估肿瘤反应情况。记录患者肿瘤大小、手术时间等临床资料。随访患者肿瘤复发及生存情况,随访截至2020年8月27日。结果21例患者中,肝功能Child-Pugh A级20例,Child-Pugh B级1例,消融术后没有出现肝功能降级情况。肿瘤长径为10~56 mm,肿瘤长径≥3 cm者共7例。21例患者共接受21次不可逆电穿孔消融治疗,技术成功率为100%。本组病例手术时间为2.3(1.5,3.5)h,术后所有的并发症均为Clavien-DindoⅠ级,包括疼痛、发热和臂丛神经拉伤。术后4周影像学检查结果显示,完全缓解率为85.7%(18/21),部分缓解率为9.5%(2/21),疾病稳定者0例,疾病进展者1例,占4.8%(1/21),客观缓解率达到95.2%(20/21)。术后3和12个月复查,3个月总体复发率9.5%(2/21),12个月的总体复发率23.8%(5/21),均为异位复发。术后3、12个月的AFP分别为(28.0±7.3)和(29.0±8.1)ng/ml,与术前(278.0±41.2)ng/ml相比均降低,差异具有统计学意义(t3个月=-3.57,t12个月=-4.12,P电穿孔消融治疗对于肝脏恶性肿瘤是一种安全有效的治疗方法。

关键词：肝肿瘤电穿孔消融技术

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电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

第二军医大学学报 2017年第10期38卷 1311-1314页

作者：张放周载鑫张丹丹房贺刘善荣第二军医大学长海医院实验诊断科解放军东部战区73901部队第二军医大学长海医院临床实验中心第二军医大学长海医院烧伤科

目的通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件。方法通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGF... 详细信息

目的通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件。方法通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞。利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24h后的转染效率。结果在低电压模式下,脉冲电压320V、质粒浓度为20μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)%,细胞存活率为(74.30±3.01)%。结论优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础。

关键词：电穿孔成纤维细胞细胞存活转染效率脉冲

电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件

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中国组织工程研究 2018年第17期22卷 2717-2721页

作者：王泽李春花张宁坤高连如陈宇安徽医科大学海军临床学院北京市100048 解放军海军总医院心血管内科北京市100048

背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体。然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染最佳条件占据重要地位。目... 详细信息

背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体。然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染最佳条件占据重要地位。目的:探讨不同电穿孔条件对脐带华通胶间充质干细胞转染率的影响,以确定最佳电转染条件。方法:通过控制电压、脉冲时长及细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测转染率。结果与结论:(1)电压自125 V至150 V,转染率呈现递增趋势,150 V时获得最大转染率,但将电压进一步调高至170 V,转染率开始显著降低;(2)脉冲时长为5.0 ms时获得最大转染率;脉冲时长为2.5 ms和7.5 ms时转染效率均有所降低;(3)与低氧培养比较,正常培养的细胞转染率更高;(4)结果表明,正常培养的脐带华通胶间充质干细胞在电压150 V、脉冲时长5.0 ms、脉冲间隔时间50 ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率。

关键词：脐带间质干细胞转染组织工程电穿孔电转染华通胶间充质干细胞华通胶低氧培养干细胞国家自然科学基金