电穿孔法可用于家蚕基因功能分析

作     者：周文林 藤原晴彦 上村望 叶爱红 武雪会 陈学东 张婷婷 曹锦如 ZHOU Wen-Lin;Haruhiko FUJIWARA;Nozomi UEMURA;YE Ai-Hong;WU Xue-Hui;CHEN Xue-Dong;ZHANG Ting-Ting;CAO Jin-Ru

作者机构：浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所杭州310021 东京大学大学院新领域创成科学研究科先端生命科学专攻日本千叶县柏市277-8562 

出 版 物：《昆虫学报》 (Acta Entomologica Sinica)

年 卷 期：2021年第64卷第7期

页      面：809-816页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

基　　金：浙江省重点研发计划(2019C02044) 浙江省农业(畜禽)新品种选育重大科技专项(2016C02054-17) 浙江省蚕蜂资源利用与创新研究重点实验室(2020E10025) 国家蚕桑产业技术体系(CARS-18-SYZ05)。 

主　　题：家蚕 电穿孔 转基因 Wnt1 RNAi 基因功能 

摘      要：【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1(Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control,NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。