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甲肝病毒3C蛋白酶识别序列有效性的研究

甲肝病毒3C蛋白酶识别序列有效性的研究

作者：胡大海吉林大学

学位级别：硕士

甲型肝炎病毒简称甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinslone首先发现的一种以肝脏损害为主的肠道小RNA病毒。HAV3C蛋白酶是HAV唯一的自身蛋白水解酶，分子量约为20kD，是具有S（丝氨酸）/C（半胱氨酸）性质的蛋白酶，其活性中心是Cys-His-Ty... 详细信息

甲型肝炎病毒简称甲肝病毒（HAV）是1973年由Feinslone首先发现的一种以肝脏损害为主的肠道小RNA病毒。HAV3C蛋白酶是HAV唯一的自身蛋白水解酶，分子量约为20kD，是具有S（丝氨酸）/C（半胱氨酸）性质的蛋白酶，其活性中心是Cys-His-Tyr。虽然不直接参与病毒RNA的复制，但是它对前体多聚蛋白的正确水解有力的保证了衣壳的形成和病毒的复制。作为蛋白水解酶，3C蛋白酶就有高度的特异性，在病毒的生命周期中起着非常重要的作用，抑制其切割活性可阻断病毒复制，因此3C蛋白酶也是甲肝病毒药物治疗研究的靶点之一。目前鉴定P3C酶切识别序列的方法为体外翻译前体多聚蛋白(兔网织红细胞裂解液)与P3C原核表达细胞裂解液30oC孵育7h。经免疫沉淀反应及SDS-PAGE确定切割条带，经蛋白N端测序确定其P3C酶切识别序列。此方法较为复杂且只能鉴定酶切位点而不能确定其P3C识别序列。本实验利用文献报道的ProIL1B-Gluc蛋白酶检测系统，经基因合成，分子克隆成功构建了含有甲肝病毒3C蛋白酶（P3C）六个不同长度酶切识别序列（P2B-P2C）的融合蛋白报告基因。通过与P3C共转染293T细胞测定荧光值的变化及相应的Western blot可以快速精确地鉴定其P3C酶切识别序列。本实验通过此方法鉴定其P2B-P2C最短酶切识别序列为LRTQSF。同时检测了ProIL1B-Gluc的荧光值与P3C转染质粒浓度的关系及最佳的检测时间。实验结果表明ProIL1B-Gluc荧光值随着P3C转染质粒浓度的增加而升高，最佳检测时间应在转染12h左右。这说明ProIL1B-Gluc对于HAV3C蛋白酶是一个较好的报告基因。在体外我们验证了随着ProIL1B-Gluc与P3C孵育时间的延长，荧光值得到了明显的上升，并有明显的Western blot切割片段。证明了P3C在体外仍然具有识别序列的功能。我们的结果有助于将ProIL1B-Gluc报告基因向其它小RNA病毒3C蛋白酶进行延伸以检测与鉴定相应的酶切识别序列，也希望借助于此荧光素酶报告基因对3C蛋白酶在分子水平可以进行更深入的研究。

关键词：甲肝病毒 3C蛋白酶 Gaussia 荧光素酶酶切位点白细胞介素

Science:研究揭示甲肝病毒导致肝损伤机制

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现代生物医学进展 2016年第31期16卷 I0001-I0002页

作者： Asuka Hirai-Yuki Lucinda Hensley David R. McGivern Olga González-López Anshuman Das Hui Feng Lu Sun Justin E. Wilson Fengyu Hu Zongdi Feng,* William Lovell Ichiro Misumi Jenny P.-Y. Ting Stephanie Montgomery John Cullen Jason K. Whitmire Stanley M. Lemon Department of Population Health and Pathobiology North Carolina State University College of Veterinary Medicine Raleigh NC 27607 USA.

肝炎研究人员长期认为被机体派来攻击肝脏中遭受病毒感染的细胞的免疫细胞导致与甲肝病毒（HAV）和其他肝炎病毒相关联的急性肝损伤。但是，在一项新的研究中。来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员发现是遭受HAV感染的细胞作出... 详细信息

肝炎研究人员长期认为被机体派来攻击肝脏中遭受病毒感染的细胞的免疫细胞导致与甲肝病毒（HAV）和其他肝炎病毒相关联的急性肝损伤。但是，在一项新的研究中。来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员发现是遭受HAV感染的细胞作出的立即的内在的抗病毒反应导致肝脏炎症。相关研究结果在线发表在Science期刊上，论文标题为＂MAVS-dependent host species range and pathogenicity of human hepatitis A virus＂。

关键词：甲肝病毒损伤机制免疫细胞肝炎病毒病毒感染研究人员急性肝损伤 range

基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

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微生物学通报 2019年第1期46卷 209-216页

作者：姚琳逄凤娇张奇庞倩倩李风铃江艳华王联珠翟毓秀中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室农业部水产品质量安全风险评估实验室(青岛) 山东青岛266071 山东华宇工学院山东德州253000

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步... 详细信息

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23

关键词：甲肝病毒 Qβ噬菌体装甲RNA 标准参考样品实时荧光RT-PCR

水体中甲肝病毒的富集和实时荧光定量PCR检测

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水体中甲肝病毒的富集和实时荧光定量PCR检测

作者：白靖宇大连理工大学

学位级别：硕士

环境水体中的安全问题目前已经受到了人们的广泛关注,肠道病毒是水体中的主要致病源,甲肝病毒就是其中最典型的一种。甲肝病毒的环境适应能力强,能在自然环境中存活很长时间,是对人类健康影响较大的污染物,已经导致了多起大规模的疾病爆... 详细信息

环境水体中的安全问题目前已经受到了人们的广泛关注,肠道病毒是水体中的主要致病源,甲肝病毒就是其中最典型的一种。甲肝病毒的环境适应能力强,能在自然环境中存活很长时间,是对人类健康影响较大的污染物,已经导致了多起大规模的疾病爆发,尤其引起了人们的关注。由于环境样本中甲肝病毒含量非常低,病毒的检测非常困难,需要一种高效、可靠的病毒富集方法,使得这一领域的发展相对缓慢。本文总结了水体中病毒常用的富集和检测方法,结合前人所取得的经验,建立了一种实用性较强的水体中甲肝病毒的富集方法,并采用了实时荧光定量PCR法检测甲肝病毒含量,对富集效率进行分析评价。本文中采用了两步法来富集水中的甲肝病毒。第一步选用了超滤的方法,用聚醚砜超滤膜将10L或以上体积的水样浓缩至近1L,并用反冲洗的方式进一步提高超滤的富集效率,实验数据表明,甲肝病毒的回收率可达到83%;第二步采用微孔滤膜进一步浓缩水样中的甲肝病毒,在实验过程中比较了滤膜孔径和材质、洗脱液、洗脱液pH值、洗脱时间对富集效果的影响。实验结果表明孔径为0.1μm的水系混合纤维素微孔滤膜对甲肝病毒的截留效果最好,富集效率达到了65%。本文中还用所建立的方法对大连市的自来水、海水等4种环境水样进行了富集,检测数据表明,建立的富集方法对实际水样中的甲肝病毒的富集效率均超过40%,对水环境中甲肝病毒含量的评估具有重要意义。

关键词：甲肝病毒超滤微滤实时荧光定量PCR 富集

鸭甲肝病毒基因A型和C型双价卵黄抗体的研制与保护效果研究

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黑龙江畜牧兽医 2015年第9期 222-224页

作者：张占龙李敏宋永鸿李梅霞青海省化隆县畜牧局青海化隆810900 青海省贵南县过马营乡畜牧兽医站青海贵南813101 青海省动物疫病预防控制中心西宁810003

鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）是导致雏鸭发生鸭病毒性肝炎的主要病原[1],鸭甲肝病毒包括3种基因型,即基因A型（DHAV-A）、基因B型（DHAV-B）和基因C型（DHAV-C）,分别对应传统血清1型、台湾新型和韩国新型[2],以前在我国... 详细信息

鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）是导致雏鸭发生鸭病毒性肝炎的主要病原[1],鸭甲肝病毒包括3种基因型,即基因A型（DHAV-A）、基因B型（DHAV-B）和基因C型（DHAV-C）,分别对应传统血清1型、台湾新型和韩国新型[2],以前在我国的流行毒株主要为基因A型鸭甲肝病毒[3-4],

关键词：鸭病毒性肝炎病毒基因甲肝病毒保护效果卵黄抗体 A型 C型 virus

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渤海湾天津沿岸海水中甲肝病毒的检测和定量

环境科学 2009年第6期30卷 1608-1613页

作者：张明露杨健赵宏朱琳赵化冰蔡宝立南开大学微生物学系生物活性材料教育部重点实验室天津300071 天津出入境检验检疫局天津300042 南开大学环境科学与工程学院天津300071 中国人民武装警察部队医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室天津300162

甲肝病毒（hepatitis A virus,HAV）是能引起传染性甲型肝炎的单链RNA病毒.用常规RT-PCR（反转录PCR）和SYBR Green实时定量RT-PCR方法,根据甲肝病毒保守的VP1-VP2基因序列设计引物,对渤海湾天津沿岸海水中的甲肝病毒进行了检测和定量分... 详细信息

甲肝病毒（hepatitis A virus,HAV）是能引起传染性甲型肝炎的单链RNA病毒.用常规RT-PCR（反转录PCR）和SYBR Green实时定量RT-PCR方法,根据甲肝病毒保守的VP1-VP2基因序列设计引物,对渤海湾天津沿岸海水中的甲肝病毒进行了检测和定量分析.9个样品取自渤海湾天津塘沽以南沿岸海水,取样时间分别是2007年夏、秋、冬季和2008年春季.海水样品先用小型超滤装置（Millipore Pellicon Mini TFF）或超滤离心管（Millipore Centricon Plus-70）浓缩,然后进行RT-PCR检测.结果表明,从9个海水样品中都能扩增出192 bp的HAV cDNA,这些cDNA的核苷酸序列与GenBank中的同源序列相似性为95%-100%.用SYBR Green实时定量RT-PCR检测了春季和冬季的6个海水样品,结果表明,海水中甲肝病毒的浓度范围为5.35×10^6-4.51×10^7virus particles/L.

关键词：海水甲肝病毒 RT-PCR 实时定量RT-PCR

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甲肝病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

中国药科大学学报 2002年第2期33卷 153-155页

作者：李宁军江培姚全胜复旦大学生命科学学院上海200433 江苏省药物研究所南京210009

目的 :为甲肝研究和诊断提供大量高效价标准化抗体。方法 :用已培养的 NJ-3株甲肝病毒 (HAV)免疫 BALB/c小鼠 ,经细胞融合技术、IFA筛选和有限稀释克隆法。结果 :建立了 6株能稳定分泌抗 HAV-单克隆 (Mc Ab)的杂交瘤细胞。经鉴定 ,其上... 详细信息

目的 :为甲肝研究和诊断提供大量高效价标准化抗体。方法 :用已培养的 NJ-3株甲肝病毒 (HAV)免疫 BALB/c小鼠 ,经细胞融合技术、IFA筛选和有限稀释克隆法。结果 :建立了 6株能稳定分泌抗 HAV-单克隆 (Mc Ab)的杂交瘤细胞。经鉴定 ,其上清和腹水的抗体效价分别为 0 .5× 10 3 ～ 1× 10 3 及 1× 10 3 ～ 2× 10 5。用免疫印迹法和间接 EL ISA分析 ,这 6株抗体分别能与 HAV的 3个抗原位点结合。结论 :成功的制备了抗 HVA的Mc Ab,在 HAAg检测中。

关键词：甲肝病毒单克隆抗体细胞融合免疫荧光法

模拟水样中甲肝病毒超滤浓缩和PEG浓缩方法的比较

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中华实验和临床病毒学杂志 2016年第1期30卷 71-75页

作者：赵霖周文亭曹经瑗毕胜利中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 通信作者:曹经瑗.Email:caojy@***

目的比较模拟水样中甲肝病毒（HAV）超滤浓缩和PEG浓缩方法，为水中HAV检测提供参考。方法向模拟水样中接种已知量的HAV，分别选用Millipore和Sartorius公司的100KD和50KD孔径的微孔超滤管及终浓度为10％聚乙二醇（PEG）-1M氯化钠（NaC... 详细信息

目的比较模拟水样中甲肝病毒（HAV）超滤浓缩和PEG浓缩方法，为水中HAV检测提供参考。方法向模拟水样中接种已知量的HAV，分别选用Millipore和Sartorius公司的100KD和50KD孔径的微孔超滤管及终浓度为10％聚乙二醇（PEG）-1M氯化钠（NaCl）沉淀的方法对模拟水样进行浓缩，采用荧光定量lit-PCR方法检测浓缩后的病毒量，用SPSS21．0对数据进行统计学分析。结果采用同一孔径不同厂家的超滤管浓缩病毒无统计学差异（P=0．25，P=0．532），对浓缩后的CT值及回收量进行分组比较，结果均表明不同处理方法有统计学差异（P：0．000〈0．05，P=0．000〈0．05），其中50KD组浓缩病毒回收率为（94．57±16．26％），100KD组浓缩病毒回收率为（52．37±14．75％），10％PEG-1．0MNaCl沉淀病毒回收效率为（63．5±8．45％）。结论超滤和PEG沉淀两种方法均可用于水样中HAV浓缩，超滤管浓缩病毒操作简便，耗时更短，选择合适孔径可以提高HAV病毒回收率，本实验中50KD超滤管HAV回收率高于100KD；PEG更适用处理大体积样本。

关键词：甲肝病毒病毒浓缩 PEG浓缩超滤荧光定量RT-PCR

F_0F_1-ATPase生物传感器快速检测食品中甲肝病毒

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食品科学 2013年第16期34卷 178-182页

作者：张捷王小晋许美玲张惠媛张雷刘岩顾德周王佩荣乐加昌陈广全北京出入境检验检疫局北京100026 淮安出入境检验检疫局江苏淮安223001 临沂出入境检验检疫局山东临沂276034 中国科学院生物物理研究所北京100101

建立一种应用F0F1-ATPase生物传感器快速检测甲肝病毒的方法。利用生物素-亲和素系统将甲肝病毒特异性分子探针连接在F0F1-ATPase的ε亚基上构建分子马达检测装置。将甲肝病毒阳性血清和阴性对照RNA分别与生物传感器结合,比较其启动ATP... 详细信息

建立一种应用F0F1-ATPase生物传感器快速检测甲肝病毒的方法。利用生物素-亲和素系统将甲肝病毒特异性分子探针连接在F0F1-ATPase的ε亚基上构建分子马达检测装置。将甲肝病毒阳性血清和阴性对照RNA分别与生物传感器结合,比较其启动ATP合成10min后的荧光强度的差别,对样品中甲肝病毒进行检测。结果表明,所建立的F0F1-ATPase生物传感器对检测食源性甲肝病毒具有良好的特异性和较高的灵敏度,对甲肝病毒核酸检测灵敏度达到0.01ng/mL,与反转录聚合酶链式反应检测结果作比较,结果具有良好一致性;本方法在1h内即可完成检测,可应用于食品中甲肝病毒的污染状况调查及高效检测。

关键词：生物传感器分子马达甲肝病毒快速检测