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甲羟戊酸激酶突变导致光敏性汗孔角化症的致病机制研究

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甲羟戊酸激酶突变导致光敏性汗孔角化症的致病机制研究

作者：朱腾飞中南大学

学位级别：硕士

目的：甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)可将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸。前期研究中在多个光敏性汗孔角化症(disseminated superficial actinic porokeratosis, DSAP)家系及散发患者中发现MVK基因突变,但是其具体的致病机制... 详细信息

目的：甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)可将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸。前期研究中在多个光敏性汗孔角化症(disseminated superficial actinic porokeratosis, DSAP)家系及散发患者中发现MVK基因突变,但是其具体的致病机制不明。本研究拟探讨MVK相关突变导致DSAP的机制,加深我们对这一疾病的认识。方法：采集正常人和患者外周血,抽提淋巴细胞总RNA, real time PCR和RT-PCR研究mRNA表达水平。构建相关真核表达载体,在HEK293中表达MVK野生型和DSAP相关突变,免疫印迹观察蛋白表达。建立MVK野生型和DSAP相关突变的HEK293稳定表达细胞系,使用放线菌酮(Chcloheximide CHX)抑制蛋白合成,在不同时间点收集蛋白,免疫印迹检测MVK野生型和DSAP相关突变型的半衰期。使用蛋白酶体抑制剂(MG132),溶酶体抑制剂(CQ)阻断MVK的降解,免疫印迹观察MVK野生型和DSAP相关突变型的降解途径。在HEK293细胞中瞬时表达GFP标签或FLAG标签的MVK野生型和DSAP相关突变型,对过氧化物酶体、线粒体、内质网等细胞器的标志蛋白进行免疫荧光染色,研究MVK野生型和DSAP相关突变型进行亚细胞定位。构建pGEX-4T-2骨架的MVK野生型及DSAP相关突变质粒,在BL21感受态中通过IPTG诱导原核表达GST融合蛋白,GST pull down研究MVK野生型和DSAP相关突变形成同源二聚体的能力。在HEK293细胞中共转GFP标签和FLAG标签的MVK野生型和/或DSAP相关突变型,免疫共沉淀研究MVK野生型和DSAP相关突变型形成同源二聚体的能力。结果：1.A189V突变患者mRNA表达低于正常人;DSAP相关突变蛋白表达低于野生型;2. DSAP目关突变蛋白的降解较野生型蛋白明显加快;DSAP野生型和相关相关突变蛋白主要通过蛋白酶体途径降解;***野生型和DSAP相关突变型为细胞质分布;MVK野生型和DSAP相关突变与过氧化物酶体、线粒体、内质网没有共定位;***野生型和A189V可以形成同源二聚体,MVK野生型不能和H312R形成同源二聚体,H312R自身不能形成同源二聚体。结论：*** DSAP相关突变的细胞亚定位没有改变。*** DSAP相关突变蛋白半衰期缩短,通过蛋白酶体途径降解。***312R形成同源二聚体的能力有缺陷。

关键词： DSAP 甲羟戊酸激酶蛋白半衰期同源二聚体

鸭疫里默氏菌甲羟戊酸激酶基因的重组表达与免疫保护效果研究

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畜牧兽医学报 2010年第8期41卷 1006-1011页

作者：吕敏娜覃宗华袁建峰孙铭飞余劲术吴彩艳蔡建平广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生实验室广州510640

在从鸭疫里默氏菌(RA)基因组文库筛选毒力基因的过程中,作者获得了编码RA甲羟戊酸激酶的基因(RAMVA),将该基因片段提交GenBank,收录号为GQ398751。测序分析结果显示其开放阅读框长492 bp,共编码163个氨基酸。根据序列信息设计引物,用PC... 详细信息

在从鸭疫里默氏菌(RA)基因组文库筛选毒力基因的过程中,作者获得了编码RA甲羟戊酸激酶的基因(RAMVA),将该基因片段提交GenBank,收录号为GQ398751。测序分析结果显示其开放阅读框长492 bp,共编码163个氨基酸。根据序列信息设计引物,用PCR方法从RA中扩增出RAMVA的编码区并与表达质粒pMAL-C2X连接,构建重组质粒pMAL-RAMVA。经限制性酶切和序列测序鉴定序列正确无误后将pMAL-RAMVA转化至***21(DE3)构建重组表达菌***21/pMAL-C2X-RAMVA。用IPTG诱导重组菌成功诱导RAMVA的表达,通过SDS-PAGE分析表达产物,表达量占全菌总蛋白的15.6%,且重组表达的甲羟戊酸激酶在大肠杆菌中表达时以可溶性状态存在。雏鸭免疫试验表明,接种重组表达菌***21/pMAL-C2X-RAMVA2周后,可产生对RA致死量攻击达42.3%的免疫保护率。

关键词：鸭疫里默氏菌甲羟戊酸激酶表达免疫保护

青天葵甲羟戊酸激酶基因的编码蛋白预测和表达分析

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热带作物学报 2015年第6期36卷 1099-1104页

作者：黄琼林何瑞詹若挺广东医学院广东湛江524023 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心广东广州510006 岭南中药资源教育部重点实验室广东广州510006

甲羟戊酸途径(mevalonic acid,MVA)是植物三萜类化合物生物合成的主要途径,而甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)是MVA途径中的关键限速酶之一。根据前期获得的青天葵[Nervilia fordii(Hance)Schltr.]转录组数据,采用生物信息学方法... 详细信息

甲羟戊酸途径(mevalonic acid,MVA)是植物三萜类化合物生物合成的主要途径,而甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)是MVA途径中的关键限速酶之一。根据前期获得的青天葵[Nervilia fordii(Hance)Schltr.]转录组数据,采用生物信息学方法对青天葵MVK基因编码蛋白的理化特性、功能结构域、二级结构、信号肽、跨膜结构域等进行预测,并采用RPKM法分析该基因在青天葵球茎和叶片的表达量。结果表明,Nf MVK基因编码含有383个氨基酸的稳定型亲水性、酸性蛋白质,与其他植物MVK蛋白同源性可达70%。Nf MVK蛋白分子量为41.29 ku,含有甲羟戊酸激酶功能域,归属于GHMP_Kinase超级家族。该蛋白没有任何信号肽、转运肽和跨膜结构域,二级结构为混合型结构的蛋白质。Nf MVK基因在青天葵中的表达趋势为:球茎>叶片。该结果可为后续利用MVK基因调控青天葵三萜类活性成分的合成提供理论依据。

关键词：青天葵甲羟戊酸激酶生物信息学表达量

杜仲甲羟戊酸激酶(EuMK)基因鉴定及生物信息学分析

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经济林研究 2014年第1期32卷 6-12页

作者：乌云塔娜王淋叶生晶中国林业科学研究院经济林研究开发中心河南郑州450003 国家林业局杜仲工程技术研究中心河南郑州450003 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室湖南长沙410004 中南林业科技大学林学院湖南长沙410004 国家林业局中南林业调查规划设计院湖南长沙410014

甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)是萜类化合物生物合成甲羟戊酸(mevalonate pathway,MVA)途径的限速酶之一。为了探明EuMK对杜仲胶生物合成的调控机制,对EuMK所编码蛋白质氨基酸序列的理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质... 详细信息

甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)是萜类化合物生物合成甲羟戊酸(mevalonate pathway,MVA)途径的限速酶之一。为了探明EuMK对杜仲胶生物合成的调控机制,对EuMK所编码蛋白质氨基酸序列的理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二、三级结构、结构保守域以及基因组内含子和外显子结构特征等进行了全面的生物信息学分析,结果发现EuMK蛋白质序列均存在3个与甲羟戊酸底物结合及催化反应有关的保守结构域;EuMK的氨基酸组成中性的疏水性蛋白居多数,属于稳定的疏水性蛋白;无明显的跨膜结构,均在膜外;二级结构为混合型结构的蛋白质。EuMK均含有4个外显子,3个内含子;EuMK基因家族启动子顺式作用元件潜在功能的预测分析发现,含有大量基本顺式作用元件TATAbox,CAATbox,还含有光(AE-box、CGT-motif、Box 4、G-box)、生长素(ERE、ABRE、TCA-element)响应等多个顺式调控元件。

关键词：杜仲甲羟戊酸激酶反式聚异戊二烯生物信息学

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甲羟戊酸激酶基因研究进展

中国农业科技导报 2011年第3期13卷 17-25页

作者：王宝莲樊庆琦李永波曲志才楚秀生山东省农业科学院作物研究所济南250100 曲阜师范大学生命科学学院山东曲阜273165

类异戊二烯是维持生物生长发育等所必需的重要有机物质,包括甾醇、长萜醇、辅酶Q、叶绿素和生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径的一系列酶酶促反应合成的。综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、基因克... 详细信息

类异戊二烯是维持生物生长发育等所必需的重要有机物质,包括甾醇、长萜醇、辅酶Q、叶绿素和生长调节剂等多种重要物质,是通过甲羟戊酸代谢途径的一系列酶酶促反应合成的。综述了该途径中的限速酶之一甲羟戊酸激酶的生物学特性、基因克隆及表达等方面的研究进展,旨在为其病虫害控制、动植物改良中的应用提供依据。

关键词：类异戊二烯甲羟戊酸激酶基因生物学特性

野生烟草甲羟戊酸激酶NsyMK基因克隆与序列分析

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作物杂志 2013年第5期 75-79页

作者：吕婧刘贯山龚达平孙玉合中国农业科学院烟草研究所/烟草行业烟草基因资源利用重点实验室山东青岛266101

甲羟戊酸激酶是植物中控制整个甲羟戊酸途径重要的限速酶,其代谢产物萜类物质是烟草芳香物质的主要来源。本研究采用同源克隆,利用RACE方法获得二倍体林烟草(Nicotiana sylvestris)甲羟戊酸激酶(NsyMK)的开放阅读框序列,对NsyMK序列进... 详细信息

甲羟戊酸激酶是植物中控制整个甲羟戊酸途径重要的限速酶,其代谢产物萜类物质是烟草芳香物质的主要来源。本研究采用同源克隆,利用RACE方法获得二倍体林烟草(Nicotiana sylvestris)甲羟戊酸激酶(NsyMK)的开放阅读框序列,对NsyMK序列进行生物信息学分析,预测蛋白理化性质、二级结构、三维结构并推测其结构与功能。结果表明,克隆获得的林烟草NsyMK的开放阅读框全长为1158bp,编码385个氨基酸,预测分子量41.4kDa、等电点为6.05,GenBank登录号KC871597。蛋白质结构分析显示NsyMK存在典型GHMP激酶和甲羟戊酸激酶保守结构域。生物信息学预测NsyMK蛋白不含跨膜区与信号肽。本研究成功克隆并分析了一个未报道的林烟草NsyMK的全长序列,为进一步阐明栽培烟草中萜类代谢途径奠定基础。

关键词：林烟草甲羟戊酸激酶萜类生物合成

暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因的重组表达与定点突变研究

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华西药学杂志 2024年第1期39卷 48-52页

作者：黄德娅邹萌黄斌翰周嘉裕廖海西南交通大学生命科学与工程学院四川成都610000

目的研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列,全化学合成FUMK-pET28a重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白,纯化后检测其酶活性。利用定点... 详细信息

目的研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列,全化学合成FUMK-pET28a重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白,纯化后检测其酶活性。利用定点突变验证关键氨基酸。结果FUMK基因ORF全长为1158 bp,编码一条长度为385个氨基酸的多肽。FUMK与卷叶贝母的甲羟戊酸激酶(MK)同源性最高,序列相似性可达77.14%。FUMK与百合科贝母属植物的MK聚类形成单系群,具有最近的亲缘关系。在大肠杆菌BL21中成功表达出FUMK重组蛋白,纯化后的重组蛋白能够催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)与甲羟戊酸反应,形成甲羟戊酸磷酸。FUMK对ATP的酶促反应最大速度(Vmax)与米氏常数(Km)值分别为1.72μmol·min^(-1)·mg^(-1)、15.84μmol·L^(-1);对甲羟戊酸的Vmax与Km值分别为0.71μmol·min^(-1)·mg-1、28.58μmol·L^(-1)。His198Ala和Ser137Ala两种突变蛋白的酶促活性分别显著减少49.08%、23.91%,表明其是FUMK行使催化功能的关键氨基酸残基。结论成功鉴定了FUMK基因,并验证了His198与Ser137两个关键氨基酸残基,为研究其基因在暗紫贝母甾体类生物碱生物合成途径中的生物学作用奠定了理论基础。

关键词：暗紫贝母甲羟戊酸激酶生物信息学分析重组表达定点突变序列比对催化反应反应速率

暴马桑黄甲羟戊酸激酶基因的克隆及差异表达分析

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吉林农业大学学报 2023年第5期45卷 547-552页

作者：刘增才孙婷婷孙健马依莎邹莉东北林业大学林学院哈尔滨150040 哈尔滨学院食品工程学院哈尔滨150086

为研究暴马桑黄(Sanghuangporus baumii)三萜合成途径的调控机制,对该途径中的关键酶——甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase,MVK)基因进行克隆及差异表达分析。以暴马桑黄cDNA为模板,采用同源克隆得到MVK基因cDNA序列全长,命名为SbMVK(登... 详细信息

为研究暴马桑黄(Sanghuangporus baumii)三萜合成途径的调控机制,对该途径中的关键酶——甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase,MVK)基因进行克隆及差异表达分析。以暴马桑黄cDNA为模板,采用同源克隆得到MVK基因cDNA序列全长,命名为SbMVK(登录号为MN793978)。生物信息学分析显示,SbMVK基因cDNA序列长1041 bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.6 ku,属于GHMP kinase超家族成员;系统进化树结果表明,暴马桑黄MVK蛋白和紫芝MVK蛋白同源性最高。采用qRT-PCR技术对暴马桑黄不同发育阶段SbMVK基因进行转录水平分析,并对相应阶段的三萜进行提取和含量测定,结果表明:暴马桑黄SbMVK基因转录水平和三萜含量均先升后降,并且二者变化趋势基本一致,推测SbMVK基因在暴马桑黄甲羟戊酸途径中参与三萜调控工作,此研究结果可为深入了解该基因在暴马桑黄三萜合成中的功能及获得高三萜产量的菌株提供理论依据。

关键词：暴马桑黄甲羟戊酸激酶三萜生物信息学分析差异表达分析

暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因（MK）的功能研究及潜在分布预测

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暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因（MK）的功能研究及潜在分布预测

作者：邹萌西南交通大学

学位级别：硕士

川贝母(Fritillaria cirrhosa ***)来源于百合科贝母属部分植物的干燥鳞茎,其作为四川道地药材,用药历史悠久。2020版《中国药典》规定川贝母药材包括“松贝”、“青贝”、“炉贝”以及“栽培品”,其中“松贝”的品质最佳。暗紫贝母(Fri... 详细信息

川贝母(Fritillaria cirrhosa ***)来源于百合科贝母属部分植物的干燥鳞茎,其作为四川道地药材,用药历史悠久。2020版《中国药典》规定川贝母药材包括“松贝”、“青贝”、“炉贝”以及“栽培品”,其中“松贝”的品质最佳。暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)的鳞茎常作为“松贝”的主流品种,临床与市场需求量极大。然而,由于暗紫贝母的生态环境较为特殊,以及人为过度开采,使得暗紫贝母的栽培问题一直未得到合理解决,导致种群数量锐减,已处于濒临灭绝的边缘。因此笔者认为利用基因工程和人工智能等技术对暗紫贝母开展资源保护与利用已迫在眉睫。本论文主要围绕有关暗紫贝母资源保护与利用的两个问题开展研究工作:问题1,暗紫贝母的指标成分为西贝母碱等,但含量较低(《中国药典》规定不少于0.05%)。目前,有关西贝母碱生物合成途径的研究极少,对西贝母碱生物合成相关酶基因开展研究,将为利用代谢工程提高西贝母碱等产量提供重要的候选靶基因,从而减少对暗紫贝母野生资源的依赖,实现暗紫贝母资源保护的目标。本论文以暗紫贝母甲羟戊酸激酶(Fritillaria unibracteata mevalonate kinase, FuMK)基因为研究对象,通过qRT-PCR确定FuMK基因在叶中表达量较高。构建了pET28a-FuMK重组载体,转化***-BL21(DE3),重组菌株在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下成功表达FuMK重组蛋白,当IPTG浓度为1 mM,诱导温度为28℃,诱导时间为8 h时,FuMK重组蛋白的可溶性表达量最高。纯化后的可溶性FuMK蛋白在RS-甲羟戊酸(RS-mevalonate,MVA)和ATP底物条件下利用Mg做金属催化剂进行酶活测定,结果表明,当c(MVA)=0.8 mmol/L,c(ATP)=1.0 mmol/L,c(Mg)=0.8mmol/L时FuMK活性最高。根据同源对比分析的结果,推测Gly142与Ser147两个氨基酸残基参与酶对ATP的结合。对两个位点进行定点突变,表达并纯化FuMK-G142K与FuMK-S147A突变重组蛋白,酶活测定结果发现突变重组蛋白的底物亲和力降低、反应效率与专一性均有所下降,但最大反应速率增加,证明氨基酸位点构象的改变会影响蛋白与底物的结合。利用花浸法获得转FuMK基因拟南芥,以野生型拟南芥为对照,初步研究发现转基因种子的萌发率降低,在干旱、盐胁迫下生物量更小但根系更发达,推测FuMK基因的过量表达可能影响转基因植株中部分次生代谢物和(或)植物激素的合成。问题2,以暗紫贝母与太白贝母等为代表的贝母属植物野生资源数量急剧下降,为缓解暗紫贝母与太白贝母等需求与野生资源短缺的矛盾,引种与人工栽培暗紫贝母与太白贝母是一种可行的选择。本论文利用最大熵模型等人工智能技术对暗紫贝母和太白贝母的潜在分布区进行预测,有利于为暗紫贝母和太白贝母的野生抚育和栽培提供依据,扩大人工培育地的范围。同时,这部分研究成果也将为其它贝母属植物的适生区分析提供理论指导。预测结果显示对暗紫贝母分布贡献率较大的环境因子分别为年降水量(26.12%)和海拔(20.11%),最适潜在分布区主要集中于甘肃西南部、青海东南部以及四川北部和西北部;对太白贝母分布贡献率较大的环境因子分别为昼夜温差均值(41.21%)和海拔(26.42%),最适潜在分布区主要集中于四川中部及东北部、重庆北部、甘肃南部、贵州西北部、陕西西南部和湖北西部。

关键词：暗紫贝母甲羟戊酸激酶突变转基因潜在分布