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水稻甲基结合蛋白基因MBD701的克隆及原核表达

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生命科学研究 2012年第2期16卷 120-124页

作者：张艳霞贾海英司志飞刘昊英孟凡荣河南农业大学生命科学学院中国河南郑州450002

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,... 详细信息

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中实现了融合蛋白GST-MBD701的表达.结果表明,MBD701除了包含典型的甲基结合域(第138～212)外,还包含CW的锌指结构(第73～132);在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下成功诱导表达了大小为65.87 kD的GST-MBD701融合蛋白,这为进一步开展MBD701的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.

关键词：水稻甲基结合蛋白基因克隆原核表达

甲基结合蛋白1对小鼠胚胎干细胞增殖及克隆形态的影响

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贵州医科大学学报 2019年第6期44卷 621-625页

作者：张鹏杨红兰刘含周艳华杨燕范安然何志旭舒莉萍贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室组织工程与干细胞实验中心贵州省再生医学重点实验室贵州贵阳550004 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室贵州贵阳550004 遵义医科大学附属医院儿科学教研室贵州遵义563000

目的:研究甲基结合蛋白1(Mbd1)对小鼠胚胎干细胞克隆形态及增殖的影响。方法:设计针对Mbd1转录起始位点的gRNA,将表达有gRNA和Cas9蛋白的质粒使用脂质体转染方法转入小鼠胚胎干细胞(J1);使用抗生素将未转染成功的细胞杀死后,细胞继续培... 详细信息

目的:研究甲基结合蛋白1(Mbd1)对小鼠胚胎干细胞克隆形态及增殖的影响。方法:设计针对Mbd1转录起始位点的gRNA,将表达有gRNA和Cas9蛋白的质粒使用脂质体转染方法转入小鼠胚胎干细胞(J1);使用抗生素将未转染成功的细胞杀死后,细胞继续培养7d,挑取单克隆细胞,采用PCR法筛选敲除Mbd1的纯合子细胞,观察Mbd1缺失对小鼠胚胎干细胞克隆形态的影响;使用细胞计数法检验Mbd1对胚胎干细胞增殖的影响。结果:通过Cripsr/Cas9成功获得敲除Mbd1的胚胎干细胞,Mbd1缺失后的小鼠胚胎干细胞丧失了常规小鼠胚胎干细胞的3D克隆形态,细胞呈现单层扁平克隆;Mbd1缺失后小鼠胚胎干细胞增殖速率变慢。结论:Mbd1通过影响小鼠胚胎干细胞克隆形态和增殖而影响胚胎干细胞的多能性。

关键词：甲基结合蛋白胚胎干细胞多能性细胞增殖神经前体细胞基因敲除

N^6-甲基腺苷相关蛋白及其对非编码RNA调控的研究进展

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环境与职业医学 2019年第1期36卷 84-89页

作者：谷仕艳曹亮何作顺大理大学公共卫生学院云南大理671000

N^6-甲基腺苷(m^6A)是指发生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰,广泛存在于多种真核生物的RNA中。当前研究显示m^6A相关蛋白主要包括催化m^6A形成的甲基转移酶、移除m^6A修饰的去甲基化酶和识别m^6A修饰的甲基结合蛋白三类。近年研究... 详细信息

N^6-甲基腺苷(m^6A)是指发生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰,广泛存在于多种真核生物的RNA中。当前研究显示m^6A相关蛋白主要包括催化m^6A形成的甲基转移酶、移除m^6A修饰的去甲基化酶和识别m^6A修饰的甲基结合蛋白三类。近年研究发现微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等非编码RNA的生成和功能发挥受到m^6A修饰的调控。本文基于近期的文献,总结了m^6A相关蛋白的种类和功能的研究进展,并对m^6A相关蛋白调控非编码RNA生成和功能发挥的机制进行归纳,以期为将来m^6A相关蛋白及其对非编码RNA的影响研究提供参考。

关键词： N6-甲基腺苷甲基转移酶去甲基化酶甲基结合蛋白微小RNA 长链非编码RNA 环状RNA

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果蝇DNA及组蛋白甲基化与寿限

生理科学进展 2012年第5期43卷 381-385页

作者：管德龙梁露张敏陕西师范大学生命科学学院西安710062

物种寿限受多种因素调控,根据现有假说,DNA甲基化与组蛋白甲基化对寿限起主动作用,并引起特征性形态学改变及衰老性生长停滞。果蝇中DNA甲基化系统包含唯一的甲基转移酶dDNMT2及唯一的甲基结合蛋白MBD2/3,二者均显示其在结构上的广泛保... 详细信息

物种寿限受多种因素调控,根据现有假说,DNA甲基化与组蛋白甲基化对寿限起主动作用,并引起特征性形态学改变及衰老性生长停滞。果蝇中DNA甲基化系统包含唯一的甲基转移酶dDNMT2及唯一的甲基结合蛋白MBD2/3,二者均显示其在结构上的广泛保守性,且表达的时期恰好与检测到DNA甲基化的时期高度一致,具有影响胚胎发育、染色体重塑、反转录转座子沉默等重要功能。果蝇中组蛋白甲基转移酶SETDB1和Su(VAR)3-9诱导的H3K9甲基化对DNA甲基化可能在上游起指导作用。H3K4甲基化与H3K27甲基化分别起活化与沉默作用,与DNA甲基化有协同或阻遏效应,越来越多的研究证实果蝇正常寿命的维持与H3K4及H3K27之间的调控密切相关,因此H3K4与H3K27的甲基化模式是新的研究热点。文章对果蝇DNA甲基化及组蛋白甲基化对于果蝇寿限影响的研究进行了综述。

关键词：果蝇寿限 DNA甲基转移酶甲基结合蛋白组蛋白甲基化修饰

小麦甲基化CpG结合域蛋白基因raMBD9的序列及功能分析

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小麦甲基化CpG结合域蛋白基因raMBD9的序列及功能分析

作者：李梦园河南农业大学

学位级别：硕士

探讨小麦发育调控的分子机制对于开展小麦高产分子育种具有重要意义,DNA甲基化在植物发育调控过程中发挥了重要功能,而CpG结合域蛋白(MBD)是一类识别DNA甲基化信号的重要功能蛋白,直接参与了依赖于DNA甲基化的发育调控过程。本研究系统... 详细信息

探讨小麦发育调控的分子机制对于开展小麦高产分子育种具有重要意义,DNA甲基化在植物发育调控过程中发挥了重要功能,而CpG结合域蛋白(MBD)是一类识别DNA甲基化信号的重要功能蛋白,直接参与了依赖于DNA甲基化的发育调控过程。本研究系统的分析了小麦中甲基结合域蛋白TaMBD9基因的转录本及其序列特征,并初步探讨了该基因在小麦发育调控过程中的生物学功能。主要研究结果如下:1.基于课题组前期克隆的TaMBD9三个部分同源基因序列,通过对小麦基因组和转录组序列比对分析,共获得TaMBD9基因的54个转录本,分别位于小麦的第4、5和6染色体群,分析不同转录本的序列信息,选择7个编码蛋白质最长的转录本作为TaMBD9基因的代表序列,依据转录本的染色体定位,分别命名为TaMBD9-6AS、TaMBD9-6BS、TaMBD9-6DS、TaMBD9-4AL、TaMBD9-5BL、TaMBD9-5DL1 和 TaMBD9-5DL2。对7个转录本的基因组结构进行分析显示,外显子数目在9-12之间,对其编码的蛋白质分析结果显示,TaMBD9-6AS/6BS/6DS分别编码2092、2088和2091个氨基酸,分子量依次为231.86kDa、231.63 kDa、232.32 kDa,TaMBD9-4AL/5BL/5DL1/5DL2 分别编码 1635、1417、1960 和 1536个氨基酸,分子量依次为183.44 kDa、156.93 kDa、218.16 kDa和170.57 kDa,等电点(pI)在5.44-6.35之间。进一步的结构域分析,TaMBD9基因家族的7个转录本包含6个保守域,其中保守域PHD1id2pike在7个转录本中均存在,该保守域在调控常染色质甲基化中发挥了重要作用。对蛋白质三维结构预测,结果显示TaMBD9-6AS、-6BS、-6DS、-5DL1和-5DL2的序列一致性较高,均由8个α-螺旋和6个β-折叠以及无规则卷曲组成,空间结构极其相似,TaMBD9-5BL由1 1个α-螺旋和6个β-折叠以及无规则卷曲组成,由于TaMBD9-4AL较TaMBD9-5BL、-5DL1和-5DL2缺失了 201个氨基酸,TaMBD9-4AL在N端缺失了 2个β-折叠。进化树聚类分析结果显示,小麦TaMBD9-6AS/6BS/6DS/4AL/5BL/5DL1/5DL2基因均与拟南芥AtMBD9同源性最高,同属于MBD家族的第Ⅴ类。对7个TaMBD9基因的转录本进行组织表达特性分析显示,TaMBD9-6AS/6BS/6DS在种子、叶、茎、根和穗中的表达量均较高,TaMBD9-4AL-5BL/5DL1/5DL2则在灌浆期的籽粒中表达量较高,在其他组织中表达量均极低,推测TaMBD9的不同转录本在小麦不同组织中发挥功能。2.为了证实小麦TaMBD9基因在发育调控过程中的生物学功能,利用农杆菌侵染法分别将过表达载体1301-TaMBD9-tORF和1301-TaMBD9-ORF导入拟南芥突MBD9基因的突变体mbd9中,经过筛选鉴定,最终获得6个1301-TaMBD9-tORF、3个1301-TaMBD9-ORF共9个T2代纯合转基因株系。分析了纯合转基因株系中植株的功能恢复情况,结果显示,在拟南芥突变体mbd9中过表达TaMBD9-tORF后,与突变体对照相比,转基因株系抽薹时间平均延迟2-3天,过表达TaMBD9-ORF后,转基因株系较突变体对照组平均延迟1-2天左右,表明TaMBD9-ORF缺少的保守域PHD domain在突变体功能恢复中发挥了一定的作用,纯合转基因株系 tORF-2-5、tORF-2-9、tORF-2-14、tORF-5-19 和 tORF-5-22 的抽薹时间恢复到与野生型Col一致,说明小麦TaMBD9基因在依赖于甲基化的开花调控过程中发挥了一定的作用,进一步对开花过程调控机制的探究仍在进行当中。突变体mbd9还有多侧枝的特点,除了开花时间的不同程度恢复,观察转基因株系的分支情况发现tORF-4-18株系恢复至单主茎无侧枝,这与野生型Col一致。此外,tORF-5-22株系的叶片长、大且扁平,tORF-2-9株系叶柄较长,叶片大,整体植株长势壮。这表明小麦TaMBD9基因的插入并进行过表达,在拟南芥的生长发育过程中发挥了重要的功能,进一步的作用机制仍在进行当中。3.利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默技术,分析了TaMBD9基因抑制表达后对小麦生长发育的影响。分别接种BSMV病毒于冬麦品种“京841”和春麦品种“豫麦18”,通过qRT-PCR技术检测证明接种目的基因的植株中TaMBD9基因表达量显著降低,观察并统计小麦生长状态和抽穗时间发现:接种了 BSMV-γ-TaMBD9病毒的植株较对照组(接种BSM

关键词：小麦甲基结合蛋白突变体功能恢复 VIGS

N^6-甲基腺苷及其调控蛋白在肿瘤中的研究进展

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医学综述 2019年第22期25卷 4412-4416页

作者：谷仕艳李萌竹何作顺大理大学公共卫生学院

N^6-甲基腺苷(m^6A)是最常见的真核生物RNA甲基化修饰,由甲基转移酶、去甲基化酶和甲基结合蛋白等共同催化调控。m^6A及其甲基转移酶、去甲基化酶和甲基结合蛋白在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤及血液肿瘤的发生发展中均有重... 详细信息

N^6-甲基腺苷(m^6A)是最常见的真核生物RNA甲基化修饰,由甲基转移酶、去甲基化酶和甲基结合蛋白等共同催化调控。m^6A及其甲基转移酶、去甲基化酶和甲基结合蛋白在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤及血液肿瘤的发生发展中均有重要的调控作用,且m^6A及其调控蛋白水平的异常还与部分肿瘤患者的预后和药物治疗效果密切相关。深入研究m^6A及其甲基转移酶、去甲基化酶和甲基结合蛋白在不同肿瘤中的作用和机制,可为肿瘤的预防、诊断和治疗提供参考。

关键词：肿瘤 N^6-甲基腺苷调控蛋白甲基转移酶去甲基化酶甲基结合蛋白

镉致肾细胞损伤中氧化应激及N^6-甲基腺苷修饰酶表达变化

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环境与职业医学 2020年第9期37卷 897-902页

作者：何作顺李萌竹谷仕艳大理大学公共卫生学院大理大学预防医学研究所云南大理671000

[背景]N^6-甲基腺苷(m^6A)修饰酶可参与细胞损伤过程,但m6A修饰酶在镉引起肾细胞损伤中有何变化尚不清楚。[目的]观察CdSO4致肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤过程中m6A修饰酶的变化水平。[方法]以不同浓度CdSO4(0、4、8、16μmol·L^-1)处... 详细信息

[背景]N^6-甲基腺苷(m^6A)修饰酶可参与细胞损伤过程,但m6A修饰酶在镉引起肾细胞损伤中有何变化尚不清楚。[目的]观察CdSO4致肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤过程中m6A修饰酶的变化水平。[方法]以不同浓度CdSO4(0、4、8、16μmol·L^-1)处理HK-2细胞24 h后对相应指标进行检测。用Hoechst染色法观察细胞凋亡水平,镜下随机选取视野计数正常细胞和凋亡细胞,计算细胞凋亡率,利用相应试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、丙二醛(MDA)含量,以蛋白免疫印迹法检测m^6A甲基转移酶中的甲基转移酶样3(METTL3)和脂肪量与肥胖相关蛋白(FTO)的蛋白表达水平,荧光定量PCR法检测YTH结构域家族蛋白1(YTHDF1)和YTH结构域家族蛋白3(YTHDF3)的mRNA水平。[结果]经0、4、8、16μmol·L^-1 CdSO4处理后,细胞凋亡率依次为6.83%、5.17%、21.17%、35.80%;4、8、16μmol·L^-1组SOD活性依次是(15.41±0.96)、(13.57±1.42)、(10.96±0.61)×10^3U·g^-1,与"0"组相比,各组均有降低(P蛋白免疫印记结果显示,METTL3蛋白相对表达水平在4、8、16μmol·L^-1时分别升高至"0"组的1.09、1.25、1.33倍,FTO蛋白相对表达水平在8、16μmol·L^-1时分别为0.81和0.74(P蛋白水平以及YTHDF1和YTHDF3的mRNA水平发生不同程度的变化。

关键词： HK-2细胞氧化应激甲基转移酶去甲基化酶甲基结合蛋白

YTHDC1 m6A修饰调控与疾病发病机制的研究进展

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中国病理生理杂志 2023年第2期39卷 352-358页

作者：韩韦钰陈远兴李超中刘围围赵永超赵然尊遵义医科大学附属医院心血管内科贵州遵义563000

表观遗传学是指DNA序列不变的情况下,基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化[1],如DNA甲基化[2]、RNA甲基化[3]、组蛋白修饰[4]、染色质构象变化[5]等。表观遗传学在真核生物中的变化主要是调控细胞增殖[6-7]、分化[8]、代谢[3,9... 详细信息

表观遗传学是指DNA序列不变的情况下,基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化[1],如DNA甲基化[2]、RNA甲基化[3]、组蛋白修饰[4]、染色质构象变化[5]等。表观遗传学在真核生物中的变化主要是调控细胞增殖[6-7]、分化[8]、代谢[3,9]、周期循环[10]以及免疫调控[11]等生物学过程,这一过程中通过某些调控分子量的变化或发生结构修饰变化等,进而靶向调节下游靶基因的生物学效应。

关键词： N6-甲基腺苷甲基结合蛋白表观遗传学

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免疫相关性血细胞减少症患者外周血CD4＋T细胞DNA甲基化异常的分析

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中华医学杂志 2014年第28期94卷 2165-2168页

作者：任悦付蓉王化泉刘惠王一浩齐薇薇陶景莲邵宗鸿天津医科大学总医院血液科 300052

目的观察免疫相关性血细胞减少症（IRP）患者CD4＋T细胞基因组DNA总体甲基化水平及甲基化相关调控基因的表达水平,探讨甲基化在IRP发病中的作用.方法选取2012年12月至2013年12月天津医科大学总医院血液科确诊的30例IRP患者（15例初治... 详细信息

目的观察免疫相关性血细胞减少症（IRP）患者CD4＋T细胞基因组DNA总体甲基化水平及甲基化相关调控基因的表达水平,探讨甲基化在IRP发病中的作用.方法选取2012年12月至2013年12月天津医科大学总医院血液科确诊的30例IRP患者（15例初治患者,15例恢复患者）及15名健康对照,以免疫磁珠法分选CD4＋T细胞,应用ELISA法测定外周血CD4＋T细胞DNA总体甲基化水平;采用反转录PCR （RT-PCR）技术检测CD4＋T细胞中甲基化相关调控基因：DNA甲基化转移酶（DNMT）和甲基结合蛋白（MBD）的mRNA表达水平,并进行相关性分析.结果 IRP患者外周血CD4＋T细胞DNA总体甲基化水平初治组和恢复组均明显低于对照组（3.525％±2.046％和4.790％±1.471％比10.101％±3.449％,均P＜0.05）;初治组DNMT3b mRNA表达水平显著低于对照组（1.332±0.785比2.077±1.059,P＜0.05）;初治组、恢复组MBD2 mRNA表达水平显著高于对照组（2.999±1.601和2.055±1.576比0.581±0.247,均P＜0.05）;初治组MBD4 mRNA表达水平显著高于对照组（2.736±2.719比1.167±1.006,P＜0.05）.IRP患者外周血CD4＋T细胞DNMT3b mRNA表达水平与DNA总体甲基化水平呈正相关（r=0.569,P＜0.01）;MBD2 mRNA表达水平与CD4＋T细胞基因组DNA甲基化水平和Th1/Th2水平均呈负相关（r=-0.763,P＜0.01;r=-0.652,P＜0.05）.CD4＋T细胞甲基化水平与CD5＋B细胞比例呈负相关（r=-0.439,P ＜0.05）.结论 IRP患者外周血CD4＋T细胞基因组DNA低甲基化和甲基化相关调控基因表达异常可能与IRP发病有关.

关键词：全血细胞减少 DNA甲基化免疫相关性血细胞减少症 DNA甲基转移酶甲基结合蛋白