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甲基对硫磷水解酶的随机突变和分子对接模拟

华中农业大学学报 2012年第3期31卷 325-331页

作者：李亚楠张彦博胡美英陈少华胡振易欣林惠花华南农业大学昆虫毒理研究室/天然农药与化学生物学教育部重点实验室广州510642

甲基对硫磷水解酶(MPH)能高效降解甲基对硫磷,并能够降解杀螟松、乙基对硫磷和毒死蜱,但降解效率依次降低。为提高MPH对毒死蜱的降解活性,采用易错PCR的方法对MPH进行随机突变,筛选到2株突变体A291V和K173R,并对其进行原核表达,结果表明... 详细信息

甲基对硫磷水解酶(MPH)能高效降解甲基对硫磷,并能够降解杀螟松、乙基对硫磷和毒死蜱,但降解效率依次降低。为提高MPH对毒死蜱的降解活性,采用易错PCR的方法对MPH进行随机突变,筛选到2株突变体A291V和K173R,并对其进行原核表达,结果表明K173R对毒死蜱的降解活性比MPH提高了41.55%。通过同源建模及与毒死蜱的分子对接对酶的结构和功能进行初步分析,结果发现氨基酸残基R72在酶与毒死蜱的结合中起着重要作用。结合口袋和关键氨基酸的变化可最终导致K173R酶活性的提高。

关键词：甲基对硫磷水解酶毒死蜱随机突变易错PCR 同源建模分子对接

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

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微生物学报 2004年第3期44卷 356-360页

作者：傅国平崔中利徐玮吴旭平李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因 ,构建了重组表达质粒pET2 9a_mpd ,将其转化至EscherichiacoliBL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,得到C 末端含有 6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶 ,用Ni NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫... 详细信息

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因 ,构建了重组表达质粒pET2 9a_mpd ,将其转化至EscherichiacoliBL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,得到C 末端含有 6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶 ,用Ni NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时 ,最适pH8 6～ 8 8,最佳反应温度 1 5℃ ;Mn2 + 、Zn2 + 、Cu2 + 可使酶活性增加 1 5 %～ 2 0 % ,Ca2 + 、Mg2 + 微弱地促进酶的作用 ,Ni2 + 对酶活性几乎无影响 ;1mmol LEDTA·Na2 + 几乎不影响酶的活性 ,而 1 0mmol LEDTA·Na2 + 对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时 ,最适pH8 6。 2 5℃时 ,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km 为 (6 8 6± 5 1 ) μmol L ,kcat为 (4 5± 6 )S- 1 ;对乙基对硫磷的米氏常数Km 为 (5 9 5± 6 0 )μmol L ,kcat为 (8± 1 )S- 1 。kcat Km

关键词：甲基对硫磷水解酶基因表达 Ni-NTA亲和层析酶活性

甲基对硫磷水解酶的酿酒酵母表面展示及在甲基对硫磷降解中的应用

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生物技术通报 2015年第3期31卷 178-184页

作者：王星星池哲甘肃省科学技术情报研究所兰州730000 中国海洋大学青岛266000

PCR扩增假单胞菌WBC-3的甲基对硫磷水解酶基因,插入表面展示质粒pYD1的多克隆位点,构建pYD1-MPH重组质粒。重组质粒转化酿酒酵母EBY100,2%半乳糖诱导甲基对硫磷水解酶表达,并利用免疫荧光检测甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母细胞表面的表达... 详细信息

PCR扩增假单胞菌WBC-3的甲基对硫磷水解酶基因,插入表面展示质粒pYD1的多克隆位点,构建pYD1-MPH重组质粒。重组质粒转化酿酒酵母EBY100,2%半乳糖诱导甲基对硫磷水解酶表达,并利用免疫荧光检测甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母细胞表面的表达展示。研究了表面展示甲基对硫磷水解酶的酶学性质和酵母工程菌对水体中甲基对硫磷的降解效果。结果表明成功构建具有全细胞甲基对硫磷水解酶催化活性的酵母工程菌,经2%半乳糖诱导48 h,表面展示甲基对硫磷水解酶比酶活力为18.2 U/mg细胞干重。表面展示甲基对硫磷水解酶的最适作用pH为9.5,最适作用温度为30℃,在p H4.0-10.5之间和45℃以下稳定性较好,Mn2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+对表面展示甲基对硫磷水解酶活性有激活作用,Na+、Fe3+、Ag+对展示酶活力有抑制作用。工程菌在1 h内对淡水中20 mg/L的甲基对硫磷的降解率在80%以上。

关键词：甲基对硫磷水解酶表面展示酿酒酵母甲基对硫磷降解

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甲基对硫磷水解酶的稳定性与分泌研究

甲基对硫磷水解酶的稳定性与分泌研究

作者：龚攀贵州大学

学位级别：硕士

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。本文的研究对象为来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och,其在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。本论文通过提高MPH的热稳定性和酸稳定性,以提... 详细信息

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。本文的研究对象为来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och,其在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。本论文通过提高MPH的热稳定性和酸稳定性,以提高其在毕赤酵母的分泌表达效率。将热稳定性突变体MPH-G194P和MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,经过120h摇瓶诱导培养发现,突变体MPH-S274Q的培养基上清的酶活力达0.7 U/mL,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白条带,进一步证明了分泌效率的提高。通过RT-PCR分析可知,热稳定性突变体MPH-S274Q的mph转录量是野生型MPH的2.1倍,hac1和kar2转录量分别比MPH高2.4和0.4倍,这在一定程度揭示了MPH-S274Q更易分泌的原因是S274Q的突变促发内质网合成了更多的蛋白质折叠因子,使MPH能够更有效地合成并分泌。由于毕赤酵母诱导培养基BMMY的pH值与MPH的最适pH不一致,所以通过改变MPH表面氨基酸的极性,构建了酸稳定性突变体MPH-K208E、MPH-K277D和双点突变体MPH-S274QK277D,使其在pH=5.0～6.0的稳定性大大提高,结果显示,突变体MPH-K277D的蛋白分泌量是野生型的14.8倍,经SDS-PAGE分析可知,蛋白的分泌量明显提高,MPH-K277D的RT-PCR结果与突变体MPH-S274Q类似。通过提高MPH的热稳定性和酸稳定性,提升了其在毕赤酵母的分泌效率,该方法为其他外源蛋白在毕赤酵母分泌表达提供了新思路。甲基对硫磷水解酶与eGFP融合表达成功,为下一步突变体探索毕赤酵母分泌机制的细胞定位提供了实验基础。

关键词：甲基对硫磷水解酶分泌热稳定性酸稳定性毕赤酵母

甲基对硫磷水解酶的固定化及其在有机磷农药残留检测及降解中的应用研究

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甲基对硫磷水解酶的固定化及其在有机磷农药残留检测及降解中的应...

作者：孙闽文江南大学

学位级别：硕士

甲基对硫磷(Methyl parathion,MP)是一类使用较多的有机磷类农药,杀虫谱广,主要用于防治水稻、茶叶、蔬菜等多种作物中的害虫。MP实现杀虫是通过抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活性从而使其致死。但是,甲基对硫磷有着较强的神经毒性,同... 详细信息

甲基对硫磷(Methyl parathion,MP)是一类使用较多的有机磷类农药,杀虫谱广,主要用于防治水稻、茶叶、蔬菜等多种作物中的害虫。MP实现杀虫是通过抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活性从而使其致死。但是,甲基对硫磷有着较强的神经毒性,同时会导致人体出现记忆力受损、头痛、言语困难等症状。目前,通过甲基对硫磷水解酶来降解甲基对硫磷是较为有效的手段之一,但是游离的甲基对硫磷水解酶有着稳定性差、降解环境要求苛刻以及不能重复利用等缺点,而固定化甲基对硫磷水解酶不但可以改进上述缺点,还可以降低工业应用中的成本,因此受到了广泛关注。本课题选用甲基对硫磷水解酶Azau-MPH作为固定化研究对象,具体研究内容如下:(1)通过水热法制备了金属有机框架MIL-88A,对其进行了SEM、XRD以及FT-IR表征以确定载体的成功制备。随后,使用制备的MIL-88A从Azau-MPH粗酶液中选择性结合目标蛋白得到Azau-MPH@MIL-88A。结果表明Azau-MPH@MIL-88A对MP的比酶活为14.9 U/mg,较游离酶提高了三倍。此外,Azau-MPH@MIL-88A的储藏稳定性显著提高,4℃下储藏60天后仍然有着80%左右的初始活性保留。最后,以固定化酶为催化剂、7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光探针制备了一种能够快速检测甲基对硫磷的荧光检测传感器,该荧光传感器的检测限为0.038μM,线性检测范围为0.038-189μM。(2)通过共沉淀法制备了ZIF-8以及固定化酶Azau-MPH@ZIF-8,且通过SEM、FT-IR以及激光共聚焦显微镜三种表征手段分别对标准ZIF-8和Azau-MPH@ZIF-8进行表征以确定Azau-MPH成功负载与ZIF-8内。结果表明,在最适条件下,固定化酶的催化比酶活为1.2 U/mg。尽管催化效率降低,但是Azau-MPH@ZIF-8的热稳定性、有机试剂耐受性以及SDS耐受性都得到了明显的改善。这表明Azau-MPH@ZIF-8能够实现在不利于游离酶发挥作用的条件下实现对MP的高效降解。此外,将Azau-MPH@ZIF-8用于实际樱桃样品的循环降解,循环使用6次后,Azau-MPH@ZIF-8保留着60%左右的初始酶活。(3)最后,为了提高固定化Azau-MPH的回收便捷性,改善Azau-MPH@ZIF-8酶活回收率低的缺点,在Azau-MPH@ZIF-8的基础上引入了FeO纳米颗粒于载体之中。通过TEM、FT-IR以及XRD三种表征手段验证了ZIF-8@FeO@Azau-MPH的成功制备。此后,对ZIF-8@FeO@Azau-MPH及游离Azau-MPH的性质进行测定,结果表明,相比于Azau-MPH@ZIF-8,ZIF-8@FeO@Azau-MPH对MP的比酶活为3.07 U/mg,且有着更为优秀的稳定性。除此之外,ZIF-8@FeO@Azau-MPH的在循环使用6次后能够保留90%左右的初始酶活,表明相比于Azau-MPH@ZIF-8,其在实际工业应用中有着更加广阔的应用前景。

关键词：甲基对硫磷甲基对硫磷水解酶金属有机框架固定化纳米材料

Pseudomonas sp.1-7中甲基对硫磷水解酶基因的克隆及酶学性质研究

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农药学学报 2011年第2期13卷 162-168页

作者：许丽初晓宇田健伍宁丰中国农业科学院生物技术研究所北京100081 轻工业环境保护研究所北京100089

为了研究和分离有机磷降解酶及其编码基因,从农药厂污水处理池的活性污泥中分离出一株可以高效降解甲基对硫磷的细菌1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。通过构建基因组文库的方法克隆了1-7的甲基对硫磷水解酶基因ophc3,该... 详细信息

为了研究和分离有机磷降解酶及其编码基因,从农药厂污水处理池的活性污泥中分离出一株可以高效降解甲基对硫磷的细菌1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。通过构建基因组文库的方法克隆了1-7的甲基对硫磷水解酶基因ophc3,该基因全长为975 bp,编码324个氨基酸,其中前24个氨基酸残基可能为信号肽序列。将其在大肠杆菌中表达,并对重组甲基对硫磷水解酶(OPHC3)进行纯化和酶学性质的研究结果表明,其酶促反应最适pH值为8.0,在pH 6.0～10.0的范围内放置30 min酶的相对活性均在70%以上;最适反应温度为45℃,但该酶不耐高温,60℃下保温10 min,相对活性降至46.77%。

关键词：甲基对硫磷水解酶文库构建基因克隆酶学性质

组合突变提高甲基对硫磷水解酶MPH热稳定性的研究

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中国农业科技导报 2015年第1期17卷 167-172页

作者：罗晓亮顾杏露田健初晓宇伍宁丰中国农业科学院生物技术研究所北京100081 扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

来源于苍白杆菌Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶MPH-Och具有优良的催化水解甲基对硫磷农药的能力,针对其热稳定性较差的缺点,通过组合3种提高蛋白热稳定性的突变策略,最终获得热稳定性改良的突变酶MPHM7,其T50达到65℃,在之前... 详细信息

来源于苍白杆菌Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶MPH-Och具有优良的催化水解甲基对硫磷农药的能力,针对其热稳定性较差的缺点,通过组合3种提高蛋白热稳定性的突变策略,最终获得热稳定性改良的突变酶MPHM7,其T50达到65℃,在之前研究热稳定性提高的四点突变酶(S274Q/T183E/K197L/S192M)的基础上又提高了5℃。同时,该突变酶的催化效率也获得了一定的提高,其kcat/Km值是四点突变酶的3.8倍。热稳定性改良突变酶的获得证实了这些提高热稳定性的方法是有效的,并且其作用具有加合性,这为分子设计改良酶蛋白热稳定性提供了新的研究思路。

关键词：甲基对硫磷水解酶热稳定性组合突变

热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响

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中国农业科技导报 2015年第3期17卷 42-48页

作者：龚攀范家佑田健伍宁丰初晓宇贵州大学药学院贵阳550025 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵... 详细信息

甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵母重组菌株经摇瓶诱导培养120 h后,培养上清的酶活力达到0.7 U/m L,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白质条带,进一步证明了分泌效率提高,该结果表明提高蛋白质的热稳定性可以作为提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌效率的一条有效途径。

关键词：甲基对硫磷水解酶分泌热稳定性毕赤酵母

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甲基对硫磷水解酶纯化与保存

广州化工 2012年第8期40卷 1-3,9页

作者：张俊卓谢卫红湖北工业大学生物工程学院发酵工程省部共建教育部重点实验室湖北武汉430068

对带有重组表达质粒***菌种进行了扩大培养,在IPTG的诱导下大量表达,获得了C-末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶。经Ni-NTA亲和层析获得了具有较高生物活性的甲基对硫磷水解酶。本文对该酶纯化的梯度洗脱条件和酶动力学进行了考... 详细信息

对带有重组表达质粒***菌种进行了扩大培养,在IPTG的诱导下大量表达,获得了C-末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶。经Ni-NTA亲和层析获得了具有较高生物活性的甲基对硫磷水解酶。本文对该酶纯化的梯度洗脱条件和酶动力学进行了考察,并通过环境对酶活性的影响检测,确定了将酶制备成冻干粉,更利于保存。

关键词：甲基对硫磷水解酶 Ni-NTA亲和层析蛋白质表达纯化