甲基对硫磷水解酶的固定化及其在有机磷农药残留检测及降解中的应用研究

作     者：孙闽文 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沐万孟

授予年度：2023年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：甲基对硫磷 甲基对硫磷水解酶 金属有机框架 固定化 纳米材料 

摘      要：甲基对硫磷(Methyl parathion,MP)是一类使用较多的有机磷类农药,杀虫谱广,主要用于防治水稻、茶叶、蔬菜等多种作物中的害虫。MP实现杀虫是通过抑制害虫神经系统中胆碱酯酶的活性从而使其致死。但是,甲基对硫磷有着较强的神经毒性,同时会导致人体出现记忆力受损、头痛、言语困难等症状。目前,通过甲基对硫磷水解酶来降解甲基对硫磷是较为有效的手段之一,但是游离的甲基对硫磷水解酶有着稳定性差、降解环境要求苛刻以及不能重复利用等缺点,而固定化甲基对硫磷水解酶不但可以改进上述缺点,还可以降低工业应用中的成本,因此受到了广泛关注。本课题选用甲基对硫磷水解酶Azau-MPH作为固定化研究对象,具体研究内容如下:(1)通过水热法制备了金属有机框架MIL-88A,对其进行了SEM、XRD以及FT-IR表征以确定载体的成功制备。随后,使用制备的MIL-88A从Azau-MPH粗酶液中选择性结合目标蛋白得到Azau-MPH@MIL-88A。结果表明Azau-MPH@MIL-88A对MP的比酶活为14.9 U/mg,较游离酶提高了三倍。此外,Azau-MPH@MIL-88A的储藏稳定性显著提高,4℃下储藏60天后仍然有着80%左右的初始活性保留。最后,以固定化酶为催化剂、7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光探针制备了一种能够快速检测甲基对硫磷的荧光检测传感器,该荧光传感器的检测限为0.038μM,线性检测范围为0.038-189μM。(2)通过共沉淀法制备了ZIF-8以及固定化酶Azau-MPH@ZIF-8,且通过SEM、FT-IR以及激光共聚焦显微镜三种表征手段分别对标准ZIF-8和Azau-MPH@ZIF-8进行表征以确定Azau-MPH成功负载与ZIF-8内。结果表明,在最适条件下,固定化酶的催化比酶活为1.2 U/mg。尽管催化效率降低,但是Azau-MPH@ZIF-8的热稳定性、有机试剂耐受性以及SDS耐受性都得到了明显的改善。这表明Azau-MPH@ZIF-8能够实现在不利于游离酶发挥作用的条件下实现对MP的高效降解。此外,将Azau-MPH@ZIF-8用于实际樱桃样品的循环降解,循环使用6次后,Azau-MPH@ZIF-8保留着60%左右的初始酶活。(3)最后,为了提高固定化Azau-MPH的回收便捷性,改善Azau-MPH@ZIF-8酶活回收率低的缺点,在Azau-MPH@ZIF-8的基础上引入了FeO纳米颗粒于载体之中。通过TEM、FT-IR以及XRD三种表征手段验证了ZIF-8@FeO@Azau-MPH的成功制备。此后,对ZIF-8@FeO@Azau-MPH及游离Azau-MPH的性质进行测定,结果表明,相比于Azau-MPH@ZIF-8,ZIF-8@FeO@Azau-MPH对MP的比酶活为3.07 U/mg,且有着更为优秀的稳定性。除此之外,ZIF-8@FeO@Azau-MPH的在循环使用6次后能够保留90%左右的初始酶活,表明相比于Azau-MPH@ZIF-8,其在实际工业应用中有着更加广阔的应用前景。