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环黄芪醇对Aβ1-42介导的体外血脑屏障损伤具有保护作用及补肾益气方药治疗阿尔茨海默病疗效的Meta分析

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环黄芪醇对Aβ1-42介导的体外血脑屏障损伤具有保护作用及补肾益...

作者：黄敏烨南京中医药大学

学位级别：硕士

目的:目前治疗阿尔茨海默病的药物主要有:胆碱脂酶抑制剂、N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂、促智药、抗氧化剂等药物治疗,但目前尚无针对其病因治疗的药物;我国中医药资源丰富,中药治疗具有多途径多靶点等特... 详细信息

目的:目前治疗阿尔茨海默病的药物主要有:胆碱脂酶抑制剂、N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂、促智药、抗氧化剂等药物治疗,但目前尚无针对其病因治疗的药物;我国中医药资源丰富,中药治疗具有多途径多靶点等特点,为明确补肾益气药物对阿尔茨海默病(AD)的疗效和安全性。本研究运用Cochrane系统评价补肾益气方药治疗阿尔茨海默病(AD)的疗效和安全性,为实验研究和临床运用提供了基础。于顾然教授自拟“补肾益精方”治疗阿尔茨海默病的临床研究提示效果确切,进一步基础试验均有良性结果,本研究提供研究黄芪的主要成分环黄芪醇对Aβ介导的体外血脑屏障模型的反应,研究补肾益精方治疗AD的机制。方法:1.评价补肾益气方药治疗阿尔茨海默病的疗效和安全性:本实验系统检索近9年PubMed、中国生物医学数据库(CBM web)、中国知网(CNKI)、维普数据库(VIP)、万方数据库(WanFang Data)的相关文献。仔细阅读文献题目、摘要、全文进行筛查,按照纳入和排除相关标准选择所有文献病选择所有符合纳入标准的文献并提取有效数据,对结果进行统计分析采用Review Manager 5.3软件对结果进行统计分析。2.探讨环黄芪醇对Aβ介导的体外血脑屏障模型损伤的保护及可能机制:①MTT法研究寡聚体Aβ1-42诱导bEnd.3细胞凋亡的最适浓度,以及环黄芪醇能够有效发挥保护作用的浓度;②采用TUNEL、DAPI双染法检测环黄芪醇对Aβ1-42寡聚体诱导的bEnd.3细胞凋亡情况的影响;③运用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)FITC/PI染色法检测环黄芪醇干预后对寡聚体Aβ1-42寡聚体引起的bEnd.3细胞凋亡情况的影响;④采用单层bEnd.3细胞体外血脑屏障模型,探究环黄芪醇对脑内Aβ清除率的具体情况。⑤采用蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测凋亡蛋白(Cyto-C、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8)、连接蛋白(Occludin、Claudin-5、ZO-1)及转运蛋白(LRP-1、P-gp、RAGE)的表达水平,进一步明确其保护血脑屏障的具体机制。研究结果:1.本次共检索出124篇文献,根据纳排标准最后筛选出9篇临床随机对照试验,Meta分析结果显示:补肾益气方药治疗组能明显改善阿尔茨海默病患者日常生活能力评价量表(ADL)评分、简易精神状态量表(MMSE)评分,治疗前后差异具有统计学意义;安全性方面,本研究纳入的9篇文献中有6篇未描述有关不良反应内容,2篇未报导不良反应,仅1篇报道不良反应但对照组与治疗组间无统计学意义;***实验检测结果提示:(1)当采用20mol·L-1的寡聚体Aβ1-42分别损伤24h时,Aβ1-42对bEnd.3细胞活力的抑制率接近50%;(2)浓度达到100μmol·L/1的环黄芪醇溶液对bErnd.3细胞产生抑制作用;(3)10-75imol·L-1环黄芪醇对寡聚体Aβ1-42介导bEnd.3细胞活力损伤具有明显改善;*** blot实验结果显示:(1)bEnd.3细胞经环黄芪醇预处理过后由寡聚体Aβ1-42介导的线粒体和死亡受体通路相关蛋白的表达水平明显下降;内皮细胞之间的紧密连接蛋白表达水平上升。4.环黄芪醇可加快可溶性Aβ跨体外单层BBB模型的清除,其机制可能与增加P-gp和LRP-1的蛋白水平,而降低RAGE表达有关。研究结论:1.目前所纳入到临床随机对照试验显示,补肾益气方药可以改善阿尔茨海默病情况,但困于本组实验数据限制,相关用药安全性仍待考核。2.环黄芪醇可以通过调节寡聚体Aβ1-42改善bEnd.3细胞凋亡情况。3.环黄芪醇能抑制Aβ1-42导致的bEnd.3细胞凋亡,促进紧密连接蛋白产生,达到改善细胞间通透性的作用。4.环黄芪醇能够有效的调节血管内皮细胞上负责转运Aβ的相关转运蛋白达到提高脑内可溶性Aβ的有效清除率的作用。

关键词：阿尔茨海默病补肾益气 Meta分析环黄芪醇

环黄芪醇选择性清除衰老细胞和抑制SASP表达的机制初探

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环黄芪醇选择性清除衰老细胞和抑制SASP表达的机制初探

作者：高东晓昆明理工大学

学位级别：硕士

随着生活水平和医疗科技的发展以及人类平均寿命的延长,我国已经开始步入老龄化社会。衰老是许多慢性疾病的首要危险因素,繁重的发病率给老年人的生活带来了极大的痛苦,同时给家庭和社会造成沉重的负担。在整体水平上,衰老表现为机体各... 详细信息

随着生活水平和医疗科技的发展以及人类平均寿命的延长,我国已经开始步入老龄化社会。衰老是许多慢性疾病的首要危险因素,繁重的发病率给老年人的生活带来了极大的痛苦,同时给家庭和社会造成沉重的负担。在整体水平上,衰老表现为机体各个器官功能的逐渐衰退,激素调控水平的下降,各器官出现退行性疾病,如白内障,骨质疏松,糖尿病,心血管疾病,神经退行性疾病和肿瘤等。衰老细胞的积累被认为是导致机体衰老的重要元凶之一。衰老细胞不仅在机体内积累,还能通过自分泌和旁分泌的方式分泌衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)进一步导致周围细胞、组织的衰老,最终导致个体衰老和老年疾病的发生。针对衰老细胞的研究发现,通过向年轻小鼠体内注射衰老细胞,会诱发年轻小鼠的衰老以及衰老相关疾病的发生。另一项研究发现,通过转基因的方法清除衰老小鼠体内的衰老细胞可以延长小鼠寿命、降低衰老相关疾病的发生。因此,靶向清除衰老细胞可能成为抗衰老的新靶点。目前在药理学方面,具有代表性的靶向衰老细胞的化合物有:达沙替尼+槲皮素、ABT263可以清除衰老细胞;JAK抑制剂鲁索替尼可以抑制衰老细胞SASP的分泌。但是达沙替尼会引起肺水肿;ABT263会引起短暂性血小板和中性粒细胞减少症;鲁索替尼作为抗癌药,长期服用会引起血小板、红细胞或白细胞的减少因此开发和研究既安全又能够有效地清除衰老细胞的化合物显得尤为重要。清除衰老细胞和抑制SASP分泌需要从整体上针对衰老细胞的不同特性进行多靶点、多途径的干预。素以整体观念,辩证论治为指导的中医药,因其具有药效持久,多靶点活性以及毒副作用少等特点和优势而备受关注。因此,我们首先利用DNA损伤剂—依托泊苷处理人胚肺成纤维细胞W2构建DNA损伤诱导的衰老细胞模型。在此基础上,采用MTT法筛选多种具有抗衰老活性的中药小分子化合物对衰老细胞的清除作用。结果显示中药黄芪中的单体成分环黄芪醇(cycloastragenol,CAG)处理衰老W2后,衰老细胞数目减少达到80%以上,且对非衰老细胞无明显作用,提示CAG对衰老W2细胞具有选择性清除作用。为了进一步验证CAG对衰老细胞的清除作用,我们利用标记β-半乳糖苷酶的探针CFDG标记衰老细胞后采用流式细胞仪检测衰老细胞数量,结果显示CAG处理组的衰老细胞数目显著减少,进一步验证了CAG对衰老细胞的清除作用。因此,CAG可能成为较安全的“senolytics”。我们通过显微镜看到CAG处理衰老W2细胞后出现了大量死亡,为了研究这一现象是否与细胞凋亡有关。我们运用Annexin V/PI双染色法检测CAG对衰老W2凋亡的影响。结果显示,与对照组相比,CAG处理组衰老细胞凋亡比例增加了30%以上。同时,我们凋亡相关蛋白的检测显示Bax/Bcl2比例明显升高,PARP出现明显切割带,进一步证明了CAG促进了衰老W2细胞的凋亡。另外,对促存活通路PI3K/Akt/mTOR的检测发现,CAG处理后,发现p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达降低,说明PI3K/Akt/mTOR信号通路也参与了CAG对衰老W2细胞的清除。我们通过Real-time PCR的方法研究CAG处理后的衰老W2细胞中SASP的表达,结果显示CAG降低了IL6,IL10,IL1β,CXCL5,CXCL10,IGBP7的m RNA表达。同时CAG抑制了与SASP表达相关的几个关键蛋白JAK2/STAT3,p38MAPK/NF-κB的表达,说明CAG抑制SASP的表达可能与JAK2/STAT3,p38MAPK/NF-κB有关。综上所述,CAG可能通过抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表达、下调促存活通路PI3K/AKT/mTOR促进衰老细胞凋亡进而清除衰老细胞,同时下调JAK/STAT3、p38MAPK/NF-κB通路抑制SASP表达。

关键词：环黄芪醇衰老凋亡 SASP

环黄芪醇大鼠体内代谢转化及对肝脏CYP450酶的影响

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环黄芪醇大鼠体内代谢转化及对肝脏CYP450酶的影响

作者：魏宝红北京中医药大学

学位级别：硕士

当今社会生活水平及医疗水平大幅度提高,世界老龄化速度加快,而我国已经提前进入老龄化社会,对抗衰老药物及抗衰老保健品的需求也越来越迫切。就目前而言,人类衰老机理比较成熟且具一定影响力的是端粒假说,其中心思想即,染色体末端端粒... 详细信息

当今社会生活水平及医疗水平大幅度提高,世界老龄化速度加快,而我国已经提前进入老龄化社会,对抗衰老药物及抗衰老保健品的需求也越来越迫切。就目前而言,人类衰老机理比较成熟且具一定影响力的是端粒假说,其中心思想即,染色体末端端粒减少,寿命缩短,生物体衰老。那么激活细胞内存在的端粒酶,就可以延长端粒长度,促进细胞分裂,从而延长寿命,达到延年益寿的效果。近年来美国Geron等生物技术公司及营养保健品公司均已证实环黄芪醇(CAG)具有显著的端粒酶激活作用,而且是目前唯一一个可在人体细胞中激活端粒酶的原料,是一种具有开发前途的抗衰老物质。目前研究人员已对CAG的药效学和药动学开展了一定的研究工作。药效学实验表明,CAG具有较为显著的抗小鼠衰老活性,其作用机制与提高T-SOD、T-AOC活力,降低MDA含量,增加HYP含量有关;大鼠口服药代动力学显示三个给药剂量组(10,20和40 ***-1)具有基本一致的达峰时间,各组Cmax和AUC0～t的增加与剂成正比,提示CAG在给药剂量区间以内是呈线性药代动力学特征;Caco-2单层细胞模拟肠吸收实验显示CAG主要以被动扩散的形式通过细胞,表明其在肠道可有效吸收;在大鼠及人肝微粒体体外代谢实验中,CAG可被广泛代谢。然而,有关CAG的口服生物利用度及其更详尽的体内过程尚不清楚;本实验将从CAG的静脉注射药代谢动力学入手,分析鉴定CAG大鼠体内代谢产物及其对大鼠肝脏药物代谢酶活性的影响,以期为CAG进一步开发利用提供实验依据。本论文主要包括以下四部分内容:文献综述主要对抗衰老药物的研究进展、黄芪甲苷及研究对象CAG的研究进展、生物样品的前处理过程及检测技术进行总结分析,以期把握抗衰老药物和CAG研究的前沿动态,并为实验的开展提供理论和技术支持。实验一包括两部分内容:(1)CAG大鼠单次静脉注射的药代动力学研究及其肝肠循环现象的验证;(2)CAG在大鼠体内经胆汁、尿液及粪便排泄及粪便中Ⅱ相代谢产物的验证。(1)CAG大鼠静脉注射药代动力学及肝肠循环现象的验证通过大鼠股静脉注射CAG注射液(10 ***-1),于注射后2,5,10,15,20,30,50,80,1 110,170,230,290,350,410 min 颈动脉采血,样品处理后,HPLC-MS测定各个时间点的血药浓度,Winnolin.V.4.1药代动力学软件采用非房室模型计算主要药动学参数,并结合前期大鼠灌胃实验结果计算大鼠口服生物利用度;通过对胆汁中排泄的研究其是否具有肝肠循环现象。本次实验研究表明:CAG大鼠口服生物利用度为17.4%,远高于黄芪甲苷仅3%的生物利用度;肝肠循环验证实验发现CAG原型在大鼠体内确实存在肝肠循环现象,而且发现CAG在大鼠体内发生异构,其异构体也经过胆汁排泄。(2)胆汁、尿液及粪便排泄粪便中Ⅱ相代谢产物的鉴定本实验通过对大鼠静脉注射CAG(10 mg·kg-1)后12 h胆汁样品、灌胃CAG(20 mg·kg-1)后24 h尿液及粪便样品进行分析,确定其排泄途径及排泄形式。结果显示大鼠静脉注射CAG(10 mg·kg-1)后12h胆汁中原型排泄量为104.4 μg·kg-1,排泄率为1.044%,CAG异构体排泄量为68.63 μ***-1,排泄率为0.6863%;在大鼠灌胃CAG 24h尿液中未检测到CAG及其异构体;而在大鼠粪便中同样检测到CAG原型及其异构体,其中原型排泄量为2.118 ***-1,排泄率为10.6%。推测CAG原型及其异构体主要排泄途径是粪便排泄,其余大部分C A G经体内代谢后以代谢物的形式排出体外。采用葡糖醛酸酶酶解实验、硫酸酯酶酶解实验,对CAG灌胃大鼠粪便中葡糖醛酸结合产物与硫酸结合产物进行定性鉴别,以SPSS17.0软件进行数据分析,葡糖醛酸酶酶解实验、硫酸酯酶酶解实验与对照组均无显著性差异,推测CAG并未以葡糖醛酸结合物与硫酸结合物的形式经粪便排泄,或存在量极低。实验二连续灌胃CAG对大鼠P450酶的抑制作用及其抑制类型分析。大鼠连续7 d灌胃CAG溶液(40 mg·kg-1·d1)诱导肝药酶后,采用Cocktail探针底物与大鼠肝微粒体体外温孵法,通过HPLC同时测定5种探针药物美托洛尔、氨苯砜、非那西丁、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的代谢消除率,评价CAG 对 CYP2D6、CYP3A4、CPY2A1、CPY2E1 和 CPY2C9 亚酶活性的影响。结果显示连续灌胃CAG对大鼠肝微粒体CPY2E1亚酶活性具有显著诱导作用,对CYP3A4亚酶活性具有显著抑制作用,而对CYP2D6、CPY2A1、和CPY2C9亚酶活性无显著影响;采用体外大鼠肝微粒体温孵法进一步研究其对CYP3A4亚酶的抑制类型,结果显示,CAG对CYP3A4亚酶的抑制类型为竞争性抑制。RT-PC

关键词：大鼠代谢产物肝脏CYP450酶环黄芪醇静脉注射药代动力学抑制作用

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环黄芪醇的生物法制备

环黄芪醇的生物法制备

作者：潘弘哲北京化工大学

学位级别：硕士

“端粒学说”在关于衰老的研究中有着很大的影响力,端粒酶延长端粒长度的作用亦被人们所认可。环黄芪醇(Cycloastragenol)为黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)及多数黄芪皂苷的苷元,是至今发现的唯一能够激活端粒酶的化合物,具有抗衰老、提高... 详细信息

“端粒学说”在关于衰老的研究中有着很大的影响力,端粒酶延长端粒长度的作用亦被人们所认可。环黄芪醇(Cycloastragenol)为黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)及多数黄芪皂苷的苷元,是至今发现的唯一能够激活端粒酶的化合物,具有抗衰老、提高免疫力等作用,在医学领域中有着广阔的应用前景。考虑到环黄芪醇的主要制备方法——酸解法、Smith降解法和酶解法——具有成本高、污染大的缺点,且关于环黄芪醇的微生物制备的方法介绍较少,因此本论文采用微生物制备环黄芪醇的方法,筛选出了能够高效水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的菌株。环黄芪醇是由黄芪甲苷水解断开分子C3位木糖和C6位葡萄糖之间的β糖苷键而得到的,根据β-葡萄糖苷酶底物特异性较弱的特点,本论文先筛选出了能够表达β-葡萄糖苷酶且酶活较高的菌株,再以黄芪甲苷为底物进行培养,筛选出了能够高效水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的菌株,并对其水解转化条件进行了优化。论文内容分为以下两个部分。(1)首先尝试从土壤中筛选菌株。建立了以筛选生产β-葡萄糖苷酶酶活较高的菌株为初筛,以筛选水解黄芪甲苷得到环黄芪醇的菌株为复筛的筛菌方法。但经过不断的尝试,没有得到理想的菌株。其次,利用该筛菌方法从腐烂的黄芪中进行筛选,成功地筛选出了 4株能够水解黄芪甲苷的菌株,经鉴定,这4株菌分别为Fusarium proliferatum、Fusarium verticillioides、Talaromyces funiculosus 和 Talaromyces stollii。其中,Fusarium proliferatum和Fusarium verticillioides能够水解掉黄芪甲苷分子上的葡萄糖,得到中间产物3-O-木糖-环黄芪醇;Talaromyces funiculosus和Talaromyces stollii能够水解掉黄芪甲苷分子上的木糖,得到中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。据此结果,推测没有得到环黄芪醇的原因是菌体分泌的酶量不够,因此取4种菌与转化培养基体积比为100%的种子液过滤后将菌体加入到转化培养基中进行转化培养,并且对其按1:1的比例两两组合后进行同样操作,最终筛选出菌株Talaromyces stollii的效果最好,环黄芪醇的产量为0.73 mg,黄芪甲苷的转化率为23.36%。(2)对筛选出的菌株Talaroryces stollii水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的转化培养基成分和转化条件进行优化,最终得出最佳的转化培养基的成分为:黄芪粉 0.80%,蛋白胨 0.60%,KH2PO4 0.04%,FeSO4 0.04%,黄芪提取物0.02%,灭菌后在接种时加入0.20%的甲醇;最佳的转化条件为:取与转化培养基体积比为100%的种子液过滤后将菌体加入到转化培养基中,培养基初始pH 5.0,装液量50 mL/250 mL,培养温度35℃,培养转速150 r/min,培养时间5天。在得到的最优条件下,环黄芪醇的产量达到2.74 mg,黄芪甲苷的转化率达到87.59%,较优化前提高了3.75倍。

关键词：黄芪甲苷环黄芪醇 β-葡萄糖苷酶菌种筛选

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨环黄芪醇对糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合的作用

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中药药理与临床 2024年第6期40卷 59-66页

作者：许洪玲张磊陈晗袁明铭王媛杨薇夏介英周静周菲成都中医药大学成都610075 四川省中医药科学院成都610041 中国科学院大学宁波华美医院宁波315010

目的:本研究旨在探讨环黄芪醇对糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合的影响及其作用机制。方法:受试动物设正常对照组、模型对照组、环黄芪醇20 mg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+IWR-1(Wnt通路抑制剂)8.2μg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+STF-31(GL... 详细信息

目的:本研究旨在探讨环黄芪醇对糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合的影响及其作用机制。方法:受试动物设正常对照组、模型对照组、环黄芪醇20 mg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+IWR-1(Wnt通路抑制剂)8.2μg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+STF-31(GLUT1抑制剂)5.8 mg/kg组。除正常对照组外,其余大鼠经腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,剪去大鼠背部标记区域的皮肤和皮下组织建立皮肤溃疡模型。大鼠按分组灌胃给药14 d,并在给药第5、10、14 d测定大鼠创面愈合率;检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量;HE染色检测创面组织的病理变化;免疫组化法检测创面组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)和内皮型一氧化氮合酶(ENOS)的表达情况;细胞划痕法检测环黄芪醇对脐静脉内皮细胞(HUVEC)在LPS诱导的炎症状态下迁移率的影响;Western blot法检测给药第10 d的创面组织和LPS诱导后的HUVEC细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、特异性顶部盘状底板反应蛋白-3(RSPO3)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白的表达情况。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠在给药第5、10 d时创面愈合率显著降低(P环黄芪醇20 mg/kg组大鼠在给药第10 d时创面愈合率显著升高(P环黄芪醇25μg/m L组细胞的迁移率明显升高(P环黄芪醇能促进糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠的创面愈合,其作用机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的激活。

关键词：环黄芪醇糖尿病性皮肤溃疡创面愈合 Wnt/β-连环蛋白信号通路糖原合成酶激酶-3β 特异性顶部盘状底板反应蛋白-3 G1/S-特异性周期蛋白-D1 基质金属蛋白酶

环黄芪醇对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡和TERT表达的影响

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环黄芪醇对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡和TERT表达的影响

作者：易忠良承德医学院

学位级别：硕士

缺血性脑血管疾病是严重威胁人类健康的常见疾病之一,在缺血性脑血管疾病发生发展过程中,会发生脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI),其严重影响疾病的治疗和预后,因此加强对脑缺血再灌注损伤的病理生理机制及防治措施... 详细信息

缺血性脑血管疾病是严重威胁人类健康的常见疾病之一,在缺血性脑血管疾病发生发展过程中,会发生脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI),其严重影响疾病的治疗和预后,因此加强对脑缺血再灌注损伤的病理生理机制及防治措施的研究成为一项重要的医学课题。黄芪是一种被广泛应用于治疗缺血性脑血管病的传统中药,在IRI方面的防治作用日益被重视。环黄芪醇(cycloastragenol,CAG)是黄芪有效部位黄芪甲苷的苷元,在体外实验中被证实有显著的端粒酶激活作用,而端粒酶是一种内源性神经保护措施,在脑缺血再灌注损伤中,过表达的端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)能起到脑保护作用。环黄芪醇对脑缺血再灌注损伤有无保护作用及其机制尚不明确。本研究通过建立脑缺血再灌注损伤大鼠模型,术前给予环黄芪醇干预,通过检测大鼠神经功能评分和脑梗死灶容积百分比,观察环黄芪醇对大鼠脑缺血再灌注损伤的减轻作用;通过免疫组化和蛋白印迹法测定大鼠脑组织中TERT表达的变化和TUNEL法检测神经元凋亡的情况,探讨环黄芪醇抑制神经元凋亡、提高TERT的表达,从而减轻脑缺血再灌注损伤的分子机制,为环黄芪醇防治脑缺血再灌注损伤提供依据。第一部分环黄芪醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的减轻作用目的:探讨环黄芪醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的减轻作用。方法:1实验对象的分组与处理选取60只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,环黄芪醇低剂量组(2.5 mg/kg/d)、中剂量组(5.0 mg/kg/d)、高剂量组(10mg/kg/d)和血塞通对照组(20 mg/kg/d),每组10只。每天灌胃给药1次,连续7天,第7天给药1h后进行造模,假手术组和模型组给予等体积的0.5%CMC-Na混悬剂。2.局灶性脑缺血再灌注模型的制备采用Zea Longa线栓法略做改良制作大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,缺血2h后拔出线栓,再灌注24h后,进行各项指标的检测。3.大鼠Garcia JH神经功能评分再灌注损伤24h后,采用双盲法,按照Garcia JH大鼠神经功能评分标准,进行神经功能评分。4.大鼠脑梗死灶容积百分比再灌注损伤24h后处死大鼠,断头取脑,经TTC染色,拍照,计算脑梗死灶容积百分比。结果:1.环黄芪醇对大鼠Garcia JH神经功能评分的影响与假手术组相比,模型组大鼠神经功能评分明显降低(P环黄芪醇中、高剂量组的神经功能评分均升高(P环黄芪醇低剂量组与模型组统计无差异(P>0.05)。2.环黄芪醇对大鼠脑梗死灶容积百分比的影响与假手术组相比,模型组大鼠脑梗死灶容积百分比显著升高(P环黄芪醇中、高剂量组、血塞通组脑梗死灶容积百分比降低(P环黄芪醇低剂量组与模型组统计无显著性差异(P>0.05)。小结:环黄芪醇能提高脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分,减小脑梗死灶容积百分比。环黄芪醇可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。第二部分环黄芪醇对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡和TERT表达的影响目的:观察环黄芪醇对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡和端粒酶逆转录酶(TERT)表达的影响,探讨环黄芪醇减轻脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法:检测TERT蛋白的表达:将雄性SD大鼠随机分成3组:假手术组、模型组、环黄芪醇组(10mg/kg/d),除假手术组外,其余各组均进行MACO造模,给药和造模方式同第一部分。在脑缺血再灌注24h后,以缺血侧脑皮质,半暗区为主要取材和观察部位,通过免疫组织化学法和蛋白印迹法检测大鼠缺血侧皮质中TERT蛋白的表达。检测神经元凋亡:将雄性SD大鼠随机分成5组:假手术组、模型组、环黄芪醇组(10mg/kg/d)、端粒酶抑制剂叠氮胸苷(ATZ)组(20mg/kg/d)、环黄芪醇(10mg/kg/d)+端粒酶抑制剂(ATZ)组(20mg/kg/d)。给药和造模方式同上,脑缺血再灌注24h后,通过TUNEL染色法检测大鼠缺血侧半暗带区神经元的凋亡指数。结果:1.免疫组化法测定TERT蛋白的表达:与假手术组相比,模型组TERT的表达升高(P环黄芪醇组TERT表达升高(P环黄芪醇组TERT蛋白表达增加(P环黄芪醇组的凋亡指数(AI)均上升(P环黄芪醇组凋亡指数(AI)明显降低(P环黄芪醇组相比,端粒酶抑制剂+环黄芪醇组凋亡

关键词：环黄芪醇脑缺血再灌注端粒酶逆转录酶细胞凋亡

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环黄芪醇保护小鼠脑缺血损伤的作用机制研究

环黄芪醇保护小鼠脑缺血损伤的作用机制研究

作者：李曼上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:脑卒中是在世界范围导致死亡和成人残疾的主要原因之一,主要分为缺血性和出血性两大类。我国最常见的卒中亚型是缺血性卒中,但目前对其治疗方法非常有限。环黄芪醇(Cycloastragenol,CAG)是从黄芪中分离提取的一种次生代谢产物,具... 详细信息

目的:脑卒中是在世界范围导致死亡和成人残疾的主要原因之一,主要分为缺血性和出血性两大类。我国最常见的卒中亚型是缺血性卒中,但目前对其治疗方法非常有限。环黄芪醇(Cycloastragenol,CAG)是从黄芪中分离提取的一种次生代谢产物,具有多种药理学作用。研究表明,环黄芪醇能够激活端粒酶、调节免疫力,对心血管疾病、脂肪肝、腹主动脉瘤等疾病模型均具有保护作用。本课题在小鼠脑缺血损伤模型中研究CAG是否对缺血性脑卒中有神经保护作用,以及其可能的作用机制。方法:对23-26g的C57BL/6雄性小鼠进行大脑中动脉闭塞手术(middle cerebral artery occlusion,MCAO),脑梗塞45分钟后实行再灌注。将手术后的小鼠随机分为MCAO组和CAG给药(MCAO+CAG)组,其中给药组又分为低剂量(5mg/kg)、中剂量(10 mg/kg)和高剂量(20 mg/kg)三个剂量组。再灌注时腹腔注射CAG,12小时后再给药一次,接下来每日两次,直到术后第3天。假手术组(Sham)和MCAO组给予溶剂对照。在脑缺血后第1天,使用滚筒跑步机实验、神经功能评分和TTC染色分别检测CAG对MCAO小鼠神经行为功能损伤和脑梗塞体积的影响;在脑缺血后第3天,使用滚筒跑步机实验、神经功能评分和步态来评价动物的神经行为功能损伤,使用尼氏染色检测动物的脑梗塞情况。使用免疫组化来检测脑缺血后第1天和第3天的大脑缺血侧皮层的神经元的丢失;通过伊文思蓝外渗法和明胶酶谱法检测CAG对血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2/9活性的影响;通过Western Blot检测紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)、组蛋白去乙酰化酶SIRT1、乙酰化p53、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、核转录因子kB(NF-kB)p65和乙酰化p65(lys310)的表达水平;使用Real-time PCR检测Sirt1和炎症因子的m RNA转录水平;通过荧光法测定CAG对SIRT1酶活性的作用;通过免疫组化染色观察缺血脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的数量。结果:在脑缺血后第1天和第3天,CAG能够明显改善MCAO小鼠的神经功能和运动功能缺失,抑制缺血脑皮层神经元的丢失,减少脑梗死体积。在脑缺血后第1天,CAG能够抑制MCAO诱导的血脑屏障破坏、MMP-9的活性升高以及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的降解。CAG能够上调缺血脑中SIRT1的m RNA和蛋白的表达水平,但不能直接激活SIRT1的酶活性。伴随着SIRT1表达的上调,CAG明显地降低了缺血脑中p53的乙酰化水平和促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值。CAG能显著抑制缺血脑内NF-kB p65向核内转移,进而降低促炎症因子TNF-α和IL-1β的m RNA转录水平。在脑缺血后第3天,CAG明显抑制了缺血脑皮层小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。CAG能够部分地降低p65在Lys310位点的乙酰化水平,但是没有达到统计学意义。结论:我们的研究结果发现,CAG对小鼠脑缺血再灌注损伤具有显著的神经保护作用。CAG可减少MCAO小鼠缺血脑皮层神经元丢失,减轻血脑屏障的破坏,改善神经行为功能缺陷,减小脑梗死体积。而且CAG的神经保护作用在脑缺血再灌注后至少持续3天。其保护作用机制可能是CAG能够上调缺血脑区SIRT1的表达,减少p53的乙酰化,从而抑制MCAO诱导的细胞凋亡;同时,CAG能抑制NF-kB的活化和神经炎症反应。我们的研究结果为CAG对抗脑缺血损伤的神经保护作用提供了药理学研究依据,提示CAG可以作为治疗缺血性脑卒中的神经保护药物进行后续的临床前和临床研究。

关键词：环黄芪醇脑缺血 SIRT1 凋亡神经炎症

环黄芪醇调控Keap1/Nrf2通路对t-BHP诱导C2C12成肌细胞氧化损伤的保护作用

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环黄芪醇调控Keap1/Nrf2通路对t-BHP诱导C2C12成肌细胞氧化损伤的...

作者：刘利山西医科大学

学位级别：硕士

目的:肌少症是指随着机体衰老以骨骼肌质量减少、力量减弱为特征的一种慢性退行性疾病。研究表明衰老伴随着活性氧(reactive oxygen species,ROS)持续累积与骨骼肌减少密切相关。本实验采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-B... 详细信息

目的:肌少症是指随着机体衰老以骨骼肌质量减少、力量减弱为特征的一种慢性退行性疾病。研究表明衰老伴随着活性氧(reactive oxygen species,ROS)持续累积与骨骼肌减少密切相关。本实验采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)诱导小鼠C2C12成肌细胞,探究黄芪中的主要成分环黄芪醇(cycloastragenol,CAG)是否对C2C12成肌细胞氧化应激损伤有保护作用,并探讨环黄芪醇对Keap1/Nrf2抗氧化通路的调节机制,为骨骼肌减少相关疾病提供治疗思路。方法:1.体外培养C2C12细胞,采用t-BHP处理C2C12细胞建立细胞氧化应激模型。分别采用0、1、10、25、50、75、100、150、200μmol/L的t-BHP处理C2C12细胞6 h,CCK-8检测细胞活力,确定t-BHP的干预浓度。用0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500μmol/L的环黄芪醇处理C2C12细胞24 h,CCK-8检测细胞活力,确定环黄芪醇的干预浓度。2.将C2C12细胞分为5组:Control组、t-BHP组(100μmol/L t-BHP)、环黄芪醇低剂量组(1μmol/L CAG+100μmol/L t-BHP)、环黄芪醇中剂量组(10μmol/L CAG+100μmol/L t BHP)、环黄芪醇高剂量组(20μmol/L CAG+100μmol/L t-BHP)。CCK-8检测不同浓度的环黄芪醇对t-BHP诱导C2C12细胞氧化损伤的影响;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;Ed U-488实验检测细胞增殖情况;DCFH-DA荧光探针法测定细胞的ROS水平;生化法检测细胞中MDA、SOD水平;Western blot检测Pax7、Myo D、Keap1、Cyto-Nrf2、Nuclear-Nrf2、HO-1蛋白表达量;细胞免疫荧光检测Nrf2核转位情况。3.敲低Nrf2,C2C12细胞分为6组(t-BHP干预浓度为100μmo/L,环黄芪醇干预浓度为20μmo/L):Control组、t-BHP组、t-BHP+si-NC组、t-BHP+si-Nrf2组、t-BHP+si-Nrf2+CAG组、t-BHP+CAG组。DCFH-DA荧光探针法测定各组细胞ROS水平;Western blot检测Pax7、Myo D、HO-1蛋白表达量。结果:***-8结果显示,小于50μmol/L的t-BHP对C2C12细胞活力无明显影响,大于75μmol/L的t-BHP对C2C12细胞产生明显的细胞毒作用。1-100μmol/L的环黄芪醇处理后,细胞活力显著升高,而500μmol/L的环黄芪醇处理后,会产生明显的细胞毒性,抑制细胞活力。因此最终选用1、10、20μmol/L环黄芪醇处理C2C12细胞24 h,100μmol/L t-BHP处理C2C12细胞6 h,作为后续实验浓度。2.C2C12细胞经t-BHP诱导后,细胞中ROS、MDA表达量升高,SOD表达量减少,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比升高,Ed U阳性增殖细胞减少,增殖相关蛋白Pax7、分化相关蛋白Myo D表达减少。与t-BHP组相比,环黄芪醇处理后能提高C2C12细胞活力,降低胞内ROS和MDA含量,提高SOD活性,Ed U阳性增殖细胞增多,环黄芪醇亦可促进细胞增殖、分化相关蛋白Pax7、Myo D的表达。环黄芪醇可通过抑制Keap1蛋白表达,促进Nrf2与Keap1解偶联后的入核表达,上调下游关键蛋白HO-1的表达。3.敲低Nrf2后,胞内ROS含量增加,HO-1蛋白水平下调,Nrf2/HO-1信号通路被抑制;Pax7、Myo D蛋白表达减少,成肌细胞增殖分化能力下降。结论:环黄芪醇可在C2C12细胞氧化损伤中发挥抗氧化保护作用,其抗氧化机制可能与抑制Keap1的表达、促进Nrf2核转位并上调下游靶分子HO-1表达相关;环黄芪醇还可促进成肌细胞增殖分化相关蛋白的表达,为肌少症的防治提供新的思路。

关键词： t-BHP C2C12成肌细胞环黄芪醇氧化应激 Keap1/Nrf2

环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用和机制

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环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用和机制

作者：王位蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的:研究不同剂量环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制。方法:30只6～8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白组、模型组、环黄苗醇高、中、低(800,400,200 mgkg-1)剂量治疗组。模型组和各剂量治疗组腹腔注射庆大... 详细信息

目的:研究不同剂量环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制。方法:30只6～8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠随机分成空白组、模型组、环黄苗醇高、中、低(800,400,200 mgkg-1)剂量治疗组。模型组和各剂量治疗组腹腔注射庆大霉素(100mgkg-1),连续7天。与此同时,治疗组灌胃环黄芪醇,空白组和模型组灌胃等量生理盐水。在末次给药后当晚,禁食禁水,次日处理。小鼠眼眶取血,检测血肌酐(CRE),血尿素氮(BUN),还原型谷胱甘肽(GSH),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。取肾脏,左侧肾脏进行苏木精-伊红染色法(HE染色)和糖原染色(PAS染色)并观察,右侧肾脏制备匀浆,检测GSH,SOD,MDA,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果:与模型组相比,治疗组可以显著降低CRE,BUN,MDA,MCP-1,TNF-α含量(P环黄芪醇对庆大霉素引起小鼠急性肾损伤有保护作用;2.环黄芪醇对庆大霉素引起小鼠急性肾损伤的保护作用的机制可能与其清除自由基和抗氧化活性有关;3.急性肾损伤进程存在Wnt-β-catenin通路激活,环黄芪醇对庆大霉素引起小鼠急性肾损伤的保护作用可能与影响Wnt-β-catenin通路有关。

关键词：环黄芪醇急性肾损伤炎症因子抗氧化