环黄芪醇的生物法制备

作     者：潘弘哲 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张鹏;侯玉庆

授予年度：2019年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：黄芪甲苷 环黄芪醇 β-葡萄糖苷酶 菌种筛选 

摘      要：“端粒学说在关于衰老的研究中有着很大的影响力,端粒酶延长端粒长度的作用亦被人们所认可。环黄芪醇(Cycloastragenol)为黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)及多数黄芪皂苷的苷元,是至今发现的唯一能够激活端粒酶的化合物,具有抗衰老、提高免疫力等作用,在医学领域中有着广阔的应用前景。考虑到环黄芪醇的主要制备方法——酸解法、Smith降解法和酶解法——具有成本高、污染大的缺点,且关于环黄芪醇的微生物制备的方法介绍较少,因此本论文采用微生物制备环黄芪醇的方法,筛选出了能够高效水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的菌株。环黄芪醇是由黄芪甲苷水解断开分子C3位木糖和C6位葡萄糖之间的β糖苷键而得到的,根据β-葡萄糖苷酶底物特异性较弱的特点,本论文先筛选出了能够表达β-葡萄糖苷酶且酶活较高的菌株,再以黄芪甲苷为底物进行培养,筛选出了能够高效水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的菌株,并对其水解转化条件进行了优化。论文内容分为以下两个部分。(1)首先尝试从土壤中筛选菌株。建立了以筛选生产β-葡萄糖苷酶酶活较高的菌株为初筛,以筛选水解黄芪甲苷得到环黄芪醇的菌株为复筛的筛菌方法。但经过不断的尝试,没有得到理想的菌株。其次,利用该筛菌方法从腐烂的黄芪中进行筛选,成功地筛选出了 4株能够水解黄芪甲苷的菌株,经鉴定,这4株菌分别为Fusarium proliferatum、Fusarium verticillioides、Talaromyces funiculosus 和 Talaromyces stollii。其中,Fusarium proliferatum和Fusarium verticillioides能够水解掉黄芪甲苷分子上的葡萄糖,得到中间产物3-O-木糖-环黄芪醇;Talaromyces funiculosus和Talaromyces stollii能够水解掉黄芪甲苷分子上的木糖,得到中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。据此结果,推测没有得到环黄芪醇的原因是菌体分泌的酶量不够,因此取4种菌与转化培养基体积比为100%的种子液过滤后将菌体加入到转化培养基中进行转化培养,并且对其按1:1的比例两两组合后进行同样操作,最终筛选出菌株Talaromyces stollii的效果最好,环黄芪醇的产量为0.73 mg,黄芪甲苷的转化率为23.36%。(2)对筛选出的菌株Talaroryces stollii水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的转化培养基成分和转化条件进行优化,最终得出最佳的转化培养基的成分为:黄芪粉 0.80%,蛋白胨 0.60%,KH2PO4 0.04%,FeSO4 0.04%,黄芪提取物0.02%,灭菌后在接种时加入0.20%的甲醇;最佳的转化条件为:取与转化培养基体积比为100%的种子液过滤后将菌体加入到转化培养基中,培养基初始pH 5.0,装液量50 mL/250 mL,培养温度35℃,培养转速150 r/min,培养时间5天。在得到的最优条件下,环黄芪醇的产量达到2.74 mg,黄芪甲苷的转化率达到87.59%,较优化前提高了3.75倍。