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猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较

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生物工程学报 2010年第12期26卷 1652-1659页

作者：张定勇孙蕾杨利敏刘文军中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室中国科学院微生物研究所分子病毒中心北京100101

为了研究猪β防御素2(PBD-2)与猪γ干扰素(PoIFNγ),采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ,在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因,并分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIF... 详细信息

为了研究猪β防御素2(PBD-2)与猪γ干扰素(PoIFNγ),采用重叠延伸PCR法合成嵌合编码序列PBD-2-PoIFNγ,在此序列的基础上扩增PoIFNγ基因,并分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ与pPICZαA-PoIFNγ。经SacI线性化,电击转化巴斯德毕赤酵母X33,筛选阳性重组子,在含0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导72h。SDS-PAGE及Western blotting结果表明,所获得的重组子能够分别分泌表达PBD-2-PoIFNγ融合蛋白与PoIFNγ。琼脂扩散法和细胞病变抑制法未检测到融合蛋白的抑菌和抗病毒活性,而PoIFNγ具有明显的抗病毒活性。圆二色谱分析显示PoIFNγ与PBD-2-PoIFNγ的螺旋和无规则卷曲含量差别较大,推测是融合蛋白未能正确折叠影响了PBD-2-PoIFNγ的活性。

关键词：重叠延伸PCR 猪β防御素2 猪γ干扰素融合蛋白毕赤酵母

猪β防御素2胁迫下大肠杆菌内参基因的稳定性分析

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河南农业大学学报 2016年第1期50卷 66-71页

作者：张坤张恒于志明陈锐博郑振宇李春丽河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

以大肠杆菌的6个管家基因(recA,aspC,ldh,gapdh,mdh,16S rRNA)作为候选的内参基因,大肠杆菌在不同浓度猪β防御素2(0、37.5、75、150 mg·L-1)的胁迫下培养不同时间(1 h和4 h)后,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术比较这6个内参基因表... 详细信息

以大肠杆菌的6个管家基因(recA,aspC,ldh,gapdh,mdh,16S rRNA)作为候选的内参基因,大肠杆菌在不同浓度猪β防御素2(0、37.5、75、150 mg·L-1)的胁迫下培养不同时间(1 h和4 h)后,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术比较这6个内参基因表达的稳定性,并通过GeNorm软件分析。结果表明,大肠杆菌中recA基因表达最稳定,其次是aspC和gapdh。并且16S rRNA的相对表达量最高,而ldh的表达量最低。

关键词：猪β防御素2 实时荧光定量PCR 大肠杆菌内参基因

猪β防御素2（pBD2）的过表达在IPEC-J2细胞中抗大肠杆菌感染的作用

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猪β防御素2（pBD2）的过表达在IPEC-J2细胞中抗大肠杆菌感染的作...

作者：梁钰河南农业大学

学位级别：硕士

与传统的抗生素相比,抗菌肽不易使病原微生物产生耐药性,是一类极具开发价值的天然抗菌制剂,有希望成为抗生素的理想替代品。猪β防御素2(pBD2)作为抗菌肽家族的一员,在猪体内广泛表达,不仅具有广泛的杀菌活性,而且具有调节免疫和炎症... 详细信息

与传统的抗生素相比,抗菌肽不易使病原微生物产生耐药性,是一类极具开发价值的天然抗菌制剂,有希望成为抗生素的理想替代品。猪β防御素2(pBD2)作为抗菌肽家族的一员,在猪体内广泛表达,不仅具有广泛的杀菌活性,而且具有调节免疫和炎症反应的功能。实验室的前期结果证明添加外源性pBD2可以有效的抵抗外源细菌的入侵和感染。本实验拟研究pBD2过表达在IPEC-J2细胞中抵抗大肠杆菌感染的作用。通过克隆pBD2的全长和成熟肽基因,构建pBD2的过表达载体,使pBD2在IPEC-J2细胞中实现过表达。用E.coli ATCC 25922和ETEC K88两种不同的E.coli感染细胞,通过平板计数法测定黏附于IPEC-J2细胞的E.coli数量变化;通过流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;并通过实时荧光定量和蛋白质免疫印迹检测细胞因子和NF-κB以及MAPK信号通路蛋白的表达水平的变化;并且,通过共聚焦显微镜观察pBD2在IPEC-J2细胞中发挥作用的位置,利用转录组测序分析全长pBD2和成熟肽pBD2在细胞中的功能差异,为进一步的研究奠定了良好的基础。本研究的主要试验结果如下:(1)成功克隆全长(fpBD2)和成熟肽(pBD2)的pBD2基因,构建了 PEGFP-N-pBD2、PEGFP-N-fpBD2、PEGFP-C-pBD2、PEGFP-C-fpBD2 四种绿色荧光重组质粒,并在 IPEC-J2细胞中实现了过表达,将不同重组质粒过表达后的细胞分别命名为IPEC-J2N-pBD2细胞、IPEC-J2N-pBD2 细胞、IPEC-J2C-pBD2 细胞、IPEC-J2C-fpBD2 细胞。(2)在 IPEC-J2N-pBD2 细胞和 IPEC-J2N-fpBD2细胞中,均显著降低了E.coli 对 IPEC-J2 细胞的黏附作用,同时显著降低了细胞的凋亡率,降低了促凋亡因子Bax和Caspase-3的表达量。在基因水平上,过表达pBD2成熟肽显著增加了 IL-1α、IL-8的表达量,过表达pBD2全长对四种炎性因子无显著变化。在E.coli ATCC 25922感染后,过表达pBD2成熟肽显著增加了 IL-1α、IL-8、TNF-α、CXCL-2 的表达量,过表达 pBD2 全长显著增加了 IL-1α和 CXCL-2的表达量。在ETECK88感染之后,过表达pBD2成熟肽显著增加了 IL-1α的表达量,过表达pBD2全长显著增加了IL-1α、TNF-α的表达量。在蛋白水平上,过表达pBD2成熟肽增加了 P65蛋白的磷酸化水平,过表达pBD2全长增加了 P38蛋白的磷酸化水平。在E.coli ATCC 25922感染后,过表达pBD2成熟肽增加了 P65蛋白的磷酸化水平,过表达pBD2全长后细胞中P38和P65蛋白的磷酸化水平均无明显变化。在ETEC K88感染之后,过表达pBD2成熟肽后细胞中P38和P65蛋白的磷酸化水平均无明显变化,过表达pBD2全长增加了 P65蛋白的磷酸化水平。表明pBD2过表达后在IPEC-J2细胞中可能通过不同的作用机制发挥促炎作用,并且全长与成熟肽pBD2可能在细胞中存在功能差异。(3)分别采用 PEGFP-N-pBD2、PEGFP-N-fpBD2、PEGFP-C-pBD2、PEGFP-C-fpBD2质粒转染IPEC-J2细胞,使pBD2在IPEC-J2细胞中过表达,结果显示通过PEGFP-N-pBD2、PEGFP-N-fpBD2、PEGFP-C-pBD2质粒转染的pBD2在细胞核和细胞质中均有分布,而以PEGFP-C-pBD2质粒转染的pBD2只分布在细胞质中,未在细胞核内分布。(4)通过转录组测序分析,发现转染PEGFP-C-pBD2和PEGFP-C-fpBD2质粒的IPEC-J2C-pBD2细胞和IPEC-J2C-fpBD2细胞中出现了 160个差异表达基因,这些差异基因对于pBD2在细胞中的位置和功能可能在其中起到重要作用,有待进一步分析。本试验研究pBD2过表达后在IPEC-J2细胞中抗细菌感染的作用,为今后pBD2在畜牧养殖中的应用提供一定的理论依据。

关键词：猪β防御素2 大肠杆菌感染亚细胞定位转录组测序

猪β防御素2体外抗金黄色葡萄球菌作用机理的初步研究

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猪β防御素2体外抗金黄色葡萄球菌作用机理的初步研究

作者：张恒河南农业大学

学位级别：硕士

哺乳动物防御素由于具有抗菌能力强、抗菌作用广泛,不易使病源微生物等产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。因此防御素被认为是一种替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景。其中猪β防御素2(pBD2),发现时间较晚,且天然... 详细信息

哺乳动物防御素由于具有抗菌能力强、抗菌作用广泛,不易使病源微生物等产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。因此防御素被认为是一种替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景。其中猪β防御素2(pBD2),发现时间较晚,且天然的pBD2资源有限,所以目前国内外对其作用机理的研究报道较少。因而,为了探明猪β防御素2的抑菌机理,本试验利用基因差异表达技术检测金黄色葡萄球菌与pBD2共培养后差异表达的基因,初步探究猪β防御素2抑制革兰氏阳性菌生长的潜在作用机理。具体的研究内容如下:1.在实验室前期构建好的工程菌株BL21-pET30a-pBD2的基础上,进行诱导表达和蛋白的纯化后进行抑菌试验,结果表明pBD2对1×10CFU/ml的金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,并随着浓度的增加和作用时间的延长而增强。2.将不同浓度的pBD2(0μg/ml、37.5μg/ml、75μg/ml和150μg/ml)与1×10CFU/ml金黄色葡萄球菌共培养1 h和4 h。分别提取菌体mRNA,然后利用GenefishingRT-PCR差异表达检测试剂盒,对金黄色葡萄球菌差异表达基因进行分析,而后进行克隆测序。结果显示金黄色葡萄球菌与pBD2共培养1 h、4 h共计切胶回收、成功克隆和测序了144个差异表达条带,有测序结果的80多个,去掉重复的,在1 h中发现11个序列;在4 h中发现12个序列。3.对差异的条带进行Blast分析,可知,本研究所得的23个差异表达片段,均能找到高度同源的已知基因。(1)与细胞膜合成、运输的相关基因有:葡萄糖转运蛋白(gluconate transporter)、膜蛋白(membrane protein)、单价阳离子逆向转运蛋白D亚基(Na(+)H(+)antIporter subunit D)、γ-氨基丁酸透通透酶(gamma-aminobutyrate permease)、杆菌肽ABC转运通透酶(bacitracin ABC transporter permease)、血红素ABC转运通透酶(heme ABC transporter permease)、MFS转运蛋白(MFS transporter)、假设蛋白(hypothetical protein)、钼辅生物合成蛋白A(molybdenum cofactor biosynthesis protein A)。(2)与DNA或RNA合成的相关基因:核酸外切酶B亚基(Excinuclease ABC subunit B)、DNA拓扑异构酶III(DNA topoisomerase III)、DNA错配修复蛋白MutL(DNA mismatch repair protein MutL)、23S rRNA、复制相关蛋白(replication-associated protein)。(3)与代谢、蛋白合成相关的基因:苯二酚氧化酶多肽(quinol oxidase polypeptide II)、阿拉伯糖转录调节因子(AraC family transcriptional regulator)、翻译起始因子IF-2(translation initiation factor 2)、翻译起始因子IF-3(translation initiation factor 3)、6-磷酸-β-半乳糖苷酶(6-phospho-beta-galactosidase)、磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucosamine mutase)、长链脂肪酸-CoA合成酶(long-chain fatty acid--CoA synthetase)、硫胺素磷酸焦磷酸化酶(thiamine-phosphate pyrophosphorylase)、依赖Zn的水解酶(Zn-dependent hydrolase)。发现金黄色葡萄球菌与pBD2共培养后的差异基因多为细胞膜上通透酶、磷酸酶和转运蛋白。4.对这些差异表达基因进行荧光定量分析,结果显示:大多数差异基因与细胞膜的组成及细胞膜间运输有关且都是表达下调,而这些差异表达基因表明pBD2对金黄色葡萄球菌的抑菌作用主要是阻碍其细胞壁或细胞膜的合成、抑制其细胞膜间运输来完成的。

关键词：猪β防御素2 蛋白纯化抗菌机理差异表达 GeneFishing技术荧光定量PCR

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猪β防御素2体外杀菌机理的初步研究

猪β防御素2体外杀菌机理的初步研究

作者：高春雨河南农业大学

学位级别：硕士

防御素是一类广泛存在于动植物体内的抗菌活性肽,富含精氨酸和半胱氨酸残基,具有广泛的生物学活性,可抑制多种病源微生物,且不会诱导细菌产生耐药性。因此防御素被认为是一种有望替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景... 详细信息

防御素是一类广泛存在于动植物体内的抗菌活性肽,富含精氨酸和半胱氨酸残基,具有广泛的生物学活性,可抑制多种病源微生物,且不会诱导细菌产生耐药性。因此防御素被认为是一种有望替代传统抗生素的新型抗微生物制剂,具有广阔的应用前景。本试验通过扫描电镜、免疫荧光及免疫电镜来确定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与p BD-2作用一定时间后的变化及其p BD-2在细菌中的位置,以期阐明p BD-2的抗菌机理,具体研究内容如下:1.本试验通过免疫组织化学对前期制备的p BD-2抗体做进一步的检测,结果显示该多克隆抗体可特异性识别肾脏和小肠中的p BD-2蛋白。2.在实验室前期构建好的工程菌株BL21-p ET30a-p BD-2的基础上,进行诱导表达和蛋白的纯化,抑菌试验结果表明p BD-2对1×109 CFU/ml的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,并随着浓度的增加和作用时间的延长而增强。3.将不同浓度的p BD-2(0μg/ml,37.5μg/ml,75μg/ml,150μg/ml)与1×109 CFU/ml的大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌共培养,离心收集菌体沉淀进行固定、脱水、复水、冷冻干燥,扫描电镜观察。观察结果发现p BD-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的损坏,出现内容物外泄等现象。4.在上述试验基础上,将与p BD-2共培养后的细菌离心,PBS清洗,固定,涂片进行免疫荧光试验。免疫荧光结果显示p BD-2基本分布在细菌外膜,也有可能进入了细菌内部,由此可以得知,p BD-2是主要作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的膜上,也不排除p BD-2穿过细胞膜进入了细胞内发生作用。5.在上述实验的基础上,将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与150μg/ml p BD-2共培养4 h进行免疫电镜分析,结果显示大肠杆菌的细胞质中细胞膜上有相对较多的p BD-2出现,而金黄色葡萄球菌主要在膜上有p BD-2。结果也表明p BD-2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌机理可能不一样,p BD-2对大肠杆菌主要作用于细胞质,而对金黄色葡萄球菌主要作用于细胞膜。总之,本研究将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与p BD-2共培养不同时间后,通过扫描电镜、免疫荧光显微镜和免疫电镜分析可知,p BD-2对细菌的杀灭是首先是与细胞膜作用,并且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用机理可能不一样。本研究为阐述p BD-2抗菌作用的机理奠定一定基础,为其在猪病防治中的应用提供有力的依据。

关键词：猪β防御素2 蛋白纯化抗菌机理免疫荧光扫描电镜免疫电镜

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猪β防御素2的体外分子改造及功能研究

猪β防御素2的体外分子改造及功能研究

作者：赵青君河南农业大学

学位级别：硕士

哺乳动物防御素由于具有抗菌能力强、抗菌作用广泛,不易使病源微生物等产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。本实验在课题组前期研究的基础上,分别对猪β防御素2进行了定点突变和DNA改组技术,并利用大肠杆菌表达系统对得到的重组pBD-2... 详细信息

哺乳动物防御素由于具有抗菌能力强、抗菌作用广泛,不易使病源微生物等产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。本实验在课题组前期研究的基础上,分别对猪β防御素2进行了定点突变和DNA改组技术,并利用大肠杆菌表达系统对得到的重组pBD-2进行表达,以及功能分析,从而进一步探讨其结构与功能关系。其主要内容如下:1.猪β防御素2基因的定点突变及活性分析在实验室前期对pBD-2进行定点突变获得突变体的基础上,进一步进行定点突变,以期增加更多的正电荷数,从而提高pBD-2的生物活性;在对突变体进行理化性质及三维结构分析的基础上,克隆并构建了BL21-PET-mpBD2-DD1D6工程菌株,结果显示:突变体均对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 25922有抗菌活性,但是其抑制活性较弱。突变体的溶血率很低,在-10%0%之间,对红细胞几乎没有毒害作用。突变体DD2、DD3在不同浓度的NaCl溶液中仍具有较好的抑菌活性,说明DD2、DD3具有较好的盐离子耐受性。2.猪β防御素2基因的DNA改组及活性分析以实验室前期构建的定点突变pBD-2基因为基础,进行DNA改组,获得了17个改组后的突变体,进一步筛选了6个突变体DS1S6,预测理化性质以及三维结构与表面电荷分布情况,构建BL21-PET-mpBD2-DD1D6工程菌株,结果显示:改组得到的突变体DS1S6在不同程度上对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 25922都表现出了较强的抗菌活性。突变体的溶血率很低(DS2除外),普遍在0%0%左右,对猪红细胞基本无害。突变体DS2、DS3和DS6在不同浓度的NaCl溶液中仍表现出了抑菌活性,说明改组后的突变体具有较好的盐离子耐受性。以上结果表明,通过对pBD-2的定点突变或者DNA改组得到了具有抗菌活性的新型猪β防御素2,但是并没有获得对S.aureus和E.coli抑制活性明显提高的突变体,多数突变体在不同时间点表现出于与pBD-2相似的抑菌活性;突变体的溶血率普遍较低,对猪红细胞毒性小;并且多数突变体对盐离子溶液耐受性好。结果也显示,猪β防御素2的抗菌活性并不单单与净正电荷数的增加有关,可能也与其他因素相关,如总平均亲水性、三维结构以及电荷分布等。

关键词：猪β防御素2 DNA改组定点突变抗菌活性

猪β防御素2体外抗大肠杆菌作用机理的初步研究

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猪β防御素2体外抗大肠杆菌作用机理的初步研究

作者：陈锐博河南农业大学

学位级别：硕士

猪防御素是近些年来发现的广泛存在于猪体内的一类抗菌肽,具有广谱高效的杀菌活性,细菌对其不易产生耐药性。因此,利用猪防御素作为传统抗生素的替代物,具有极大的潜力。其中猪β防御素2(pBD-2),发现时间较晚,且天然的pBD-2资源有限,所... 详细信息

猪防御素是近些年来发现的广泛存在于猪体内的一类抗菌肽,具有广谱高效的杀菌活性,细菌对其不易产生耐药性。因此,利用猪防御素作为传统抗生素的替代物,具有极大的潜力。其中猪β防御素2(pBD-2),发现时间较晚,且天然的pBD-2资源有限,所以目前国内外对其作用机理的研究报道较少。而大量研究表明,防御素抑制杀灭细菌的特殊作用机理是其不易使细菌产生耐药性的重要原因之一。因而,为了探明猪β防御素2的抑菌机理,本试验利用基因差异表达技术体外检测与pBD-2共培养的大肠杆菌内源性基因的表达差异,初步探究猪β防御素2抑制革兰氏阴性菌生长的潜在作用机理。具体的研究内容如下:1、利用本实验室前期已经构建的携带猪β防御素2的工程菌株BL21-pET30a-pBD-2,进行诱导表达。通过SDS-PAGE分析目的蛋白的分子量,经过超声波破碎,镍离子柱亲和层析纯化得到融合蛋白,检测纯度达到95%以上。蛋白纯化后进行抑菌试验分析,结果显示,pBD-2对大肠杆菌有明显的抑杀作用。2、在上述试验的基础上,选择浓度150μg/ml的pBD-2与大肠杆菌(E.Coli ATCC 25922标准菌株)共培养一定时间(1h和4h)。分别提取菌体总RNA,然后利用GenefishingTMRT-PCR差异表达检测试剂盒,对与pBD-2共培养不同时间的大肠杆菌差异表达基因进行检测,并进一步筛选差异表达基因进行克隆测序。结果发现大肠杆菌与pBD-2共培养1h,发现差异表达条带共计12个,切胶回收后,成功克隆和测序片段7个;与pBD-2共培养4h,发现差异表达条带18个,切胶回收后,成功克隆和测序片段9个。3、利用半定量PCR及荧光定量PCR技术,进一步检测筛选得到的差异表达片段的表达丰度。结果最终确定:与pBD-2共培养1h,大肠杆菌中确定的差异表达片段为3个;与pBD-2共培养4h的大肠杆菌中确定差异表达条带5个。4、利用荧光定量PCR筛选得到的差异表达片段的序列,进行生物信息学分析,结果表明:本研究所得的差异表达片段,均能找到高度同源的已知基因。其中与pBD-2共培养1h,大肠杆菌中确定的表达差异的基因3个,分别是转移-信使RNA(1OSaRNA)(下调)、调控RNA的CsrB家族(regulatory RNA CsrB)(上调)、乳糖操纵子阻遏因子(Lactose operon repressor/lactose-inducible lac operon transcriptional repressor)(下调);与pBD-2共培养4h,大肠杆菌中表达差异基因5个,分别为海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase)(下调)、一种假设蛋白(Hypothetical protein)(下调)、钾离子转运ATP酶亚单位B(potassium transporting ATPase subunit B)(上调)、磷酸组氨酸磷酸酶(phosphohistidine phosphatase)(下调)、另一种假设蛋白(Hypothetical protein)(下调)。其中大肠杆菌与pBD-2共培养1h发现的差异表达基因大多属于调控基因,大肠杆菌与pBD-2共培养4h发现的差异表达基因大多数属于表达功能蛋白的基因,这可能与pBD-2抑菌程序有关。而这些差异表达基因中,表示pBD-2抑菌作用有阻碍蛋白质或酶的合成、参与细菌DNA或RNA的调控、增强细菌细胞膜的通透性、阻碍细菌细胞壁或细胞膜的合成等,后续试验需进一步验证。本试验通过对不同共培养时间的大肠杆菌中差异表达基因的检测,发现猪β防御素2能够导致大肠杆菌内源性基因表达丰度的改变。为进一步阐明猪β防御素2抑制革兰氏阴性菌生长的潜在作用机理,以及其在猪病防治中的应用奠定一定基础。

关键词：猪β防御素2 蛋白纯化抗菌机理差异表达 GeneFishing技术荧光定量PCR

重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定

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中国兽医学报 2010年第8期30卷 1028-1031页

作者：解民仲飞李秀锦吴凌娟李凌李巍河北农业大学动物科技学院河北保定071001

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成。将合成的基因通过SnaBⅠ和NotⅠ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌... 详细信息

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成。将合成的基因通过SnaBⅠ和NotⅠ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2。利用电穿孔法将经SalⅠ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子。经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合。阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2。琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。

关键词：猪β防御素2 毕赤酵母分泌表达抗菌活性

猪β防御素-2定点突变基因的克隆表达及其活性分析

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猪β防御素-2定点突变基因的克隆表达及其活性分析

作者：黄仙仙河南农业大学

学位级别：硕士

防御素是生物界广泛存在的一类具有微生物抗性的低分子肽,其中哺乳动物防御素的抗菌谱最广,具有很高的应用潜力。猪β防御素-2以其广谱高效的杀菌活性、不易使微生物对其产生耐药性及细胞毒性小等特点倍受人们的关注。本研究以猪β防御... 详细信息

防御素是生物界广泛存在的一类具有微生物抗性的低分子肽,其中哺乳动物防御素的抗菌谱最广,具有很高的应用潜力。猪β防御素-2以其广谱高效的杀菌活性、不易使微生物对其产生耐药性及细胞毒性小等特点倍受人们的关注。本研究以猪β防御素-2氨基酸序列为基础,设计定点突变,并对其定点突变基因进行克隆表达及蛋白活性分析。具体的研究内容如下：1.利用生物信息学手段,预测分析含有不同突变位点的PBD2理化性质,从中选择了二级结构不变,净电荷含量增加、两亲性强、比较稳定的突变点。2.以实验室已经得到的猪β防御素-2基因为模板,设计合成含突变碱基的引物,通过PCR扩增山8个定点突变基因序列(即mpBD2-1～8),连接PMD19-T克隆载体,经限制性内切酶NcoI和HindⅢ双酶切之后连接到pET30a质粒上后转进表达菌株BL21(DE3)PlysS中,成功构建了不同突变点的工程菌株。3.对工程菌株BL21-pET30a-mpBD2-1～8进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明目的蛋白的分子量与预期的基本相符,并且目的蛋白的含量约占总蛋白含量的12.8%。经超声波破碎,镍离子柱亲和层析纯化得到融合蛋白,纯度可以达到90%以上。对其进行抑菌活性和溶血活性分析。结果显示,所有突变的防御素均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用,且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强一些。溶血试验发现,这些防御素的溶血率均低于5%,其细胞毒性很小。综合分析筛选山了mPBD2-1、mPBD2-2、mPBD2-3三种相对未突变的PBD2抗菌活性较高的新型防御素,为进一步的多点突变和结构功能关系的研究打下基础。

关键词：猪β防御素2 定点突变基冈抑菌活性溶血活性