猪β防御素-2定点突变基因的克隆表达及其活性分析

作     者：黄仙仙 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵卫东;李春丽

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：猪β防御素2 定点突变基冈 抑菌活性 溶血活性 

摘      要：防御素是生物界广泛存在的一类具有微生物抗性的低分子肽,其中哺乳动物防御素的抗菌谱最广,具有很高的应用潜力。猪β防御素-2以其广谱高效的杀菌活性、不易使微生物对其产生耐药性及细胞毒性小等特点倍受人们的关注。本研究以猪β防御素-2氨基酸序列为基础,设计定点突变,并对其定点突变基因进行克隆表达及蛋白活性分析。具体的研究内容如下：1.利用生物信息学手段,预测分析含有不同突变位点的PBD2理化性质,从中选择了二级结构不变,净电荷含量增加、两亲性强、比较稳定的突变点。2.以实验室已经得到的猪β防御素-2基因为模板,设计合成含突变碱基的引物,通过PCR扩增山8个定点突变基因序列(即mpBD2-1～8),连接PMD19-T克隆载体,经限制性内切酶NcoI和HindⅢ双酶切之后连接到pET30a质粒上后转进表达菌株BL21(DE3)PlysS中,成功构建了不同突变点的工程菌株。3.对工程菌株BL21-pET30a-mpBD2-1～8进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明目的蛋白的分子量与预期的基本相符,并且目的蛋白的含量约占总蛋白含量的12.8%。经超声波破碎,镍离子柱亲和层析纯化得到融合蛋白,纯度可以达到90%以上。对其进行抑菌活性和溶血活性分析。结果显示,所有突变的防御素均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用,且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强一些。溶血试验发现,这些防御素的溶血率均低于5%,其细胞毒性很小。综合分析筛选山了mPBD2-1、mPBD2-2、mPBD2-3三种相对未突变的PBD2抗菌活性较高的新型防御素,为进一步的多点突变和结构功能关系的研究打下基础。