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二维液相色谱-质谱法研究犬肾小管上皮细胞脂质组成及马兜铃酸(Ⅰ)对其影响

质谱学报 2016年第4期37卷 289-300页

作者：聂洪港刘冉冉杨悠悠刘虎威白玉北京大学分析测试中心北京100871 北京分子科学国家实验室生物有机与分子工程教育部重点实验室北京大学化学与分子工程学院分析化学研究所北京100871 中粮营养健康研究院营养健康与食品安全北京市重点实验室北京102209

采用在线正反相二维液相色谱-质谱联用技术研究了犬肾小管上皮细胞脂质组成及马兜铃酸（Ⅰ）对其影响。二维色谱的第一维用于分离不同种类脂质,第二维用于分离同类脂质的不同分子,进而利用高分辨质谱对脂质分子进行检测。该方法减少了... 详细信息

采用在线正反相二维液相色谱-质谱联用技术研究了犬肾小管上皮细胞脂质组成及马兜铃酸（Ⅰ）对其影响。二维色谱的第一维用于分离不同种类脂质,第二维用于分离同类脂质的不同分子,进而利用高分辨质谱对脂质分子进行检测。该方法减少了共流出,降低了电离抑制,提高了灵敏度与准确性。借助精确质荷比检索数据库、高分辨二级质谱和当量碳数与保留时间规律等方法检测了犬肾小管上皮细胞中13类脂质的1 416个脂质分子。选取11种外源性脂质标准品进行方法验证,方法的线性关系、检测限、重复性均满足检测要求。在此基础上,考察了犬肾小管上皮细胞暴露于马兜铃酸（Ⅰ）后的脂质变化情况,对改变含量2~4倍的15个脂质分子进行了鉴定。该实验结果可为马兜铃酸的毒理、病理研究和相关疾病的临床诊断提供丰富的信息,并展现了二维液相色谱-质谱法在脂质组学研究中广阔的应用前景。

关键词：二维液相色谱-质谱犬肾小管上皮细胞马兜铃酸脂质组学

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番茄红素对赭曲霉毒素A诱导犬肾小管上皮细胞毒性损伤的缓解作用

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南京农业大学学报 2022年第3期45卷 587-596页

作者：赵杰周天红刘选辉冯士彬辜丽川李玉吴金节王希春安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 宠颐生天红宠物医院安徽合肥230011 安徽农业大学信息与计算机学院安徽合肥230036

[目的]本试验以犬肾小管上皮细胞(Madin-Daby canine kidney cell,MDCK)为模型,研究赭曲霉毒素A(OTA)对MDCK的毒性作用以及番茄红素(lycopene,LYC)对细胞损伤的缓解效应。[方法]将对数生长期MDCK,随机分为对照组(无添加)、OTA组(15μmol... 详细信息

[目的]本试验以犬肾小管上皮细胞(Madin-Daby canine kidney cell,MDCK)为模型,研究赭曲霉毒素A(OTA)对MDCK的毒性作用以及番茄红素(lycopene,LYC)对细胞损伤的缓解效应。[方法]将对数生长期MDCK,随机分为对照组(无添加)、OTA组(15μmol·L^(-1) OTA)、LYC组(55μmol·L^(-1) LYC)、O+L组(15μmol·L^(-1) OTA+55μmol·L^(-1) LYC),处理36 h,研究OTA对MDCK细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化、炎性因子等指标的影响,并探讨LYC在OTA致MDCK损伤中的缓解作用。[结果]OTA作用导致细胞发生明显皱缩,细胞数量骤减;电镜结果显示OTA能够导致细胞膜破裂、细胞器出现不同程度损伤,MDCK中乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)水平与丙二醛(MDA)含量极显著增加(P细胞中肾功能相关指标N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子1(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)均极显著升高(P细胞间衔接紧密,细胞凋亡率显著下降;LDH、ROS、MDA水平(含量)降低,SOD、CAT、GSH-Px活性升高,并降低炎性细胞因子的表达。[结论]OTA能够抑制MDCK活性,改变细胞形态,导致肾功能指标、氧化与抗氧化功能与细胞炎性因子异常,加快细胞凋亡;LYC能够显著缓解OTA对MDCK的损伤。

关键词：赭曲霉毒素A 番茄红素犬肾小管上皮细胞细胞损伤

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番茄红素对赭曲霉素A诱导犬肾小管上皮细胞毒性损伤的保护效应研究

番茄红素对赭曲霉素A诱导犬肾小管上皮细胞毒性损伤的保护效应研究

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作者：刘选辉安徽农业大学

学位级别：硕士

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）是霉菌毒素中毒性很强的一种,并且具有极强的肾脏毒性,会引起肾脏的多种病变。番茄红素（Lycopene,LYC）作为一种重要的类胡萝卜素,对单态氧和自由基有较强的清除能力,是极强的抗氧化剂。据此本研究提出... 详细信息

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）是霉菌毒素中毒性很强的一种,并且具有极强的肾脏毒性,会引起肾脏的多种病变。番茄红素（Lycopene,LYC）作为一种重要的类胡萝卜素,对单态氧和自由基有较强的清除能力,是极强的抗氧化剂。据此本研究提出“LYC可影响OTA诱导的肾脏损伤”的理论假说,将以犬肾小管上皮细胞（Madin-darby canine kidney,MDCK）为模型,研究OTA对MDCK细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化等指标的影响,并探讨了LYC在OTA致MDCK损伤中的保护效应。对MDCK处理36 h,光学显微镜观察细胞的形态学、透射电镜观察细胞超微结构变化,生化分析仪等检测犬肾功能相关指标,ELISA检测研究OTA对MDCK的氧化与抗氧化能力的影响,流式细胞仪检测OTA对MDCK的凋亡率影响,ELISA检测OTA对MDCK的炎性损伤情况,选择空白对照组、15μM OTA组、55μM LYC组和15μM OTA+55μM LYC四个组,综合研究OTA对MDCK的毒性作用及LYC对OTA致MDCK毒性损伤的保护效应。试验结果显示:***能抑制MDCK的细胞活性,15μM的OTA能够极显著地降低MDCK的细胞活率（P＜0.01）。倒置光学显微镜下观察结果显示,OTA作用导致细胞发生明显皱缩,生长状态大幅变差,细胞数量骤减,相互之间排列疏松;电镜结果显示OTA能够导致细胞受损、胞膜褶皱、胞膜发生破裂、胞质中细胞器不同程度损伤、线粒体空泡化;LYC能够有效缓减OTA造成的损伤,细胞存活率升高,缓解了细胞超微结构的损伤。***经OTA作用结果显示,细胞中乳酸脱氢酶（LDH）及肾功能相关指标N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）、β2-微球蛋白（β2-MG）、肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、肾损伤分子-1（KIM-1）、视黄醇结合蛋白（RBP）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）均出现极显著的升高（P＜0.01）,且LDH释放量极显著升高（P＜0.01）。***诱导MDCK的凋亡作用的检测和氧化及炎性指标结果表明,OTA能导致MDCK凋亡率极显著升高（P＜0.01）,OTA能够对MDCK造成氧化及炎性损伤,能够极显著增加MDCK的活性氧（ROS）表达量（P＜0.01）,降低超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性（P＜0.01）,增加丙二醛（MDA）的表达量（P＜0.01）,并且极显著增加MDCK的肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）、干扰素-6（IL-6）、干扰素-18（IL-18）及干扰素-1β（IL-1β）的表达量（P＜0.01）。4.通过LYC对OTA诱导MDCK毒性损伤保护作用,结果显示,LYC能够显著缓解OTA对MDCK的细胞毒性损伤,维系肾功能指标的正常水平,修正氧化与抗氧化之间的失衡,抑制细胞凋亡的发生,并降低炎性细胞因子的表达（P＜0.01）。综上所述,OTA染毒能够抑制MDCK活性,破坏细胞器及其超微结构,引起细胞肾功能指标、LDH、炎性因子指标异常,造成细胞氧化损伤,并最终诱导其发生凋亡。而添加LYC能够有效缓解OTA造成的损伤,显著提高抗氧化酶活性,降低OTA诱导的氧化损伤效应,起到保护细胞完整性和降低细胞的损伤及凋亡的作用。

关键词：赭曲霉毒素A 番茄红素犬肾小管上皮细胞细胞凋亡炎性损伤氧化损伤

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复方防石添加剂对模型小鼠草酸钙尿结石的防控效果及机制初探

复方防石添加剂对模型小鼠草酸钙尿结石的防控效果及机制初探

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作者：孙嘉豪南京农业大学

学位级别：硕士

犬尿石症是临床上常见的泌尿系统疾病。其发病与性别、年龄、品种、饮食等因素有关。近年来,犬草酸钙尿结石的发病率在不断上升,且有超过磷酸铵镁尿结石的趋势。因此研究犬草酸钙尿结石的形成机理和防治有重要的临床意义。本研究对南京... 详细信息

犬尿石症是临床上常见的泌尿系统疾病。其发病与性别、年龄、品种、饮食等因素有关。近年来,犬草酸钙尿结石的发病率在不断上升,且有超过磷酸铵镁尿结石的趋势。因此研究犬草酸钙尿结石的形成机理和防治有重要的临床意义。本研究对南京地区多家代表性动物医院2018年10月至2019年12月期间47个犬尿石症病例进行流行病学调查分析,并对收集到的尿结石样本进行化学成分分析,初步评估了南京地区在一年多时间里犬尿结石的发生情况;通过建立小鼠草酸钙尿结石模型和同步给小鼠灌胃复方防石添加剂的饲养试验,评估了复方防石添加剂对小鼠肾机能生化指标、尿液pH和肾脏抗氧化指标以及对肾脏组织病理学变化和钙盐沉积的影响;利用体外培养犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞),研究硒蛋氨酸在草酸钙诱导的MDCK细胞氧化损伤中的作用,通过检测细胞活性、细胞内活性氧水平及骨桥蛋白(OPN)mRNA和蛋白的表达水平,评估硒对MDCK细胞的保护作用并探索其机制,为临床防控犬草酸钙尿结石的研究奠定一定的理论基础。试验一、南京地区犬尿石症的发病情况调查本试验收集了南京地区2018年10月至2019年12月多家具有代表性的动物医院的犬尿石症病例47例,通过流行病学调查并利用结石分析试剂盒对尿结石化学成分进行分析。结果发现,本次调查研究中,各种类型结石所占比例为:磷酸铵镁结石占46.81%(22/47),草酸钙结石占38.30%(18/47),尿酸盐结石占8.51%(4/47),胱氨酸结石占4.26%(2/47),其他结石占2.13%(1/47)。犬的年龄、性别、品种及饮食结构均对尿结石的发生部位和类型有一定程度的影响。本次调查结果可为南京地区犬尿石症的防治和研究方向提供基础资料。试验二、复方防石添加剂对模型小鼠草酸钙尿结石的防控效果初探本试验采用1%乙二醇自由饮水和2%氯化铵每日灌胃的方式建立小鼠草酸钙结石动物模型。在构建模型的同时,同步给小鼠灌胃低、中和高剂量的复方防石添加剂进行为期28天的干预试验。期间定期记录小鼠体重变化,观察精神状态及死亡情况;检测各组小鼠血清钙、镁、磷、肌酐、尿素氮及尿液pH、肾脏指数和肾组织草酸含量;通过对小鼠肾脏进行HE染色、Von Kossa染色,观察肾组织病理损伤和钙盐沉积情况;通过检测肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力以及丙二醛(MDA)的含量,分析防石添加剂对肾脏氧化应激的影响。结果发现:随着造模试剂的应用,造模组和3个剂量组小鼠精神状态变差,各组体重均呈缓慢上升的趋势,尽管试验早期造模组小鼠体重下降显著,随后缓慢上升,但仍与对照组差异显著(P细胞浸润减轻、肾小管上皮细胞水肿减缓、管腔较小、结晶量减少和炎性细胞浸润减轻;Von Kossa染色结果发现,各剂量组较造模组黑色钙盐沉积明显减少。以上结果表明,本复方防石添加剂能有效缓解草酸钙结晶引起的肾脏氧化应激及肾机能的损伤,并能减少草酸钙结晶在肾脏的形成和黏附。试验三、硒抵抗草酸钙诱导的犬肾小管上皮细胞病变的作用研究本试验研究硒抵抗草酸钙(COM)损伤犬肾小管上皮细胞(MDCK细胞)的作用。在体外通过CCK-8法筛选出草酸钙的最佳作用条件和硒蛋氨酸(SeMet)的安全浓度。在此基础上,同时将草酸钙和不同安全浓度的硒蛋氨酸处理MDCK细胞,通过检测细胞活性、细胞内的活性氧水平、OPN mRNA和蛋白的表达来评估硒抵抗草酸钙对MDCK细胞损伤的作用,并探索其可能机制。结果发现:400 μg/mL的COM细胞培养液作用MDCK细胞12 h,细胞活性呈现显著性下降(P<0.05),筛选出的SeMet安全浓度分别为1、2、4、8 μM。随着SeM

关键词：犬草酸钙尿结石复方防石添加剂硒小鼠犬肾小管上皮细胞

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基于MDCKII细胞的体外肾毒性生物标志物评价

基于MDCKII细胞的体外肾毒性生物标志物评价

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2016年第六届全国药物毒理学年会

作者：邱宣周晓冰汪巨峰苗玉发李波中国医学科学院北京协和医学院中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室中国食品药品检定研究院

目的由于对肾毒性物质的靶器官选择性,高通量肾脏体外模型已经逐渐成为用于药物肾毒性研究的一个重要替代方法。用犬肾远端小管上皮细胞系（MDC KII）研究药物的肾毒性和生物标志物的表达,探讨其作为评价药物肾毒性替代方法的可能性。... 详细信息

目的由于对肾毒性物质的靶器官选择性,高通量肾脏体外模型已经逐渐成为用于药物肾毒性研究的一个重要替代方法。用犬肾远端小管上皮细胞系（MDC KII）研究药物的肾毒性和生物标志物的表达,探讨其作为评价药物肾毒性替代方法的可能性。方法研究已知具有明显肾毒性的药物庆大霉素、顺铂、环孢素和马兜铃酸I对细胞的毒性作用,以及相关酶学指标和生物标志物的表达。用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞的存活率计算IC50,倒置相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪分析细胞的凋亡,全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）的变化,液相芯片多因子检测生物标志物肾损伤因子（KIM-1）,半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin C）、丛生蛋白（Cluisterin）,骨桥素（Osteopontin）,中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）,单核细胞趋化蛋白（MCP-1）和白介素-8（IL-8）的表达,Real-Time PCR进一步验证生物标志物的mRNA水平。结果 MDCKII细胞系在庆大霉素、顺铂、环孢素和马兜铃酸I作用24 h的IC50分别为（18.0±1.0）mmol·L-1,（30.1±1.0）μmol·L-1,（19.6±1.2）μmol·L-1和（17.5±1.5）μmol·L-1;庆大霉素（20.0 mmol·L-1）,顺铂（30μmol·L-1）,环孢素（20μmol·L-1）和马兜铃酸I（20μmol·L-1）分别与MDCKII细胞作用24 h,倒置相差显微镜下观察到细胞皱缩,部分脱落;分别将顺铂（10,20μmol·L-1）作用于MDCKII细胞24 h,凋亡细胞由12.8%增加至17.6%;马兜铃酸I（4,8μmol·L-1）,环孢素（4,8μmol·L-1）,顺铂（5,10μmol·L-1）和庆大霉素（4,8 mmol·L-1）分别与MDCKII细胞作用6,24和48 h后,生化检测结果显示与对照组相比,给药后细胞上清中ALP的表达并无显著性差异,GGT和LDH的表达有显著的统计学差异;液相芯片多因子检测结果显示KIM-1,NGAL,Cystatin C,MCP-1和IL-8均有表达,但与对照组相比,并无显著性差异,Osteopontin和Clusterin的蛋白和mRNA表达有显著的统计学差异。结论肾毒性药物庆大霉素、顺铂、环孢素、和马兜铃酸I对MDCKII细胞具有明显的细胞毒性,Osteopontin和Clusterin的表达具有一定的灵敏度,可作为MDC KII细胞模型的肾毒性评价指标,在新药研发早期进行体外肾毒性快速筛选。

关键词：犬肾小管上皮细胞肾毒性细胞毒性生物标志物

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