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Microcystin-LR对体外牛子宫内膜上皮细胞增殖和凋亡的影响

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东北农业大学学报 2022年第6期53卷 29-37页

作者：张贵学李晓宇黄富硕马铭钧王子铭冯瑞李玉龙许钟峯郑鹏东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030

使用Microcystin-LR体外处理牛子宫内膜上皮细胞,探究其对细胞活率影响及分子调控机制,以期为提高牛繁殖效率提供理论基础和实践依据。试验运用CCK-8检测MC-LR处理后细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率;Annexin V-FITC... 详细信息

使用Microcystin-LR体外处理牛子宫内膜上皮细胞,探究其对细胞活率影响及分子调控机制,以期为提高牛繁殖效率提供理论基础和实践依据。试验运用CCK-8检测MC-LR处理后细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率;Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡;实时荧光定量检测Pi3k、Akt、mTOR、Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和p53基因mRNA表达量。Western blot检测Pi3k、Akt、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量。结果表明,不同浓度和时间处理下细胞存活率出现升高和降低两种相反情况,根据CCK-8检测结果,选择12 h,100μg·L^(-1)和24 h,160μg·L^(-1)两种处理方案开展后续试验。在12 h,100μg·L^(-1)条件下,Pi3k、Akt、mTOR的mRNA表达量升高(P细胞数量减少(P细胞数量增加(P细胞12 h,细胞通过增强Pi3k-Akt-mTOR信号通路,抑制线粒体凋亡通路促进细胞增殖,同时导致处于G1期细胞数量减少、G2/M期和S期细胞数量增加。160μg·L^(-1)MC-LR处理细胞24 h,细胞通过活化线粒体凋亡通路发生凋亡。

关键词：牛牛子宫内膜上皮细胞 MC-LR Pi3k-Akt 线粒体凋亡

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精氨酸对干扰素-tau处理牛子宫内膜上皮细胞基因表达的影响

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中国畜牧兽医 2021年第7期48卷 2495-2503页

作者：余婕胡修忠向敏王定发陶弼菲夏瑜陶虎熊琪程蕾武汉市农业科学院武汉430065 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室武汉430064

试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),... 详细信息

试验旨在研究精氨酸(Arg)对干扰素-tau(interferon-tau,IFNT)处理的牛子宫内膜上皮细胞的调控作用及其可能的机制。将牛子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养板中,当达到70%~80%融合度时,向细胞培养基中加入不同浓度的IFNT(0、100 ng/mL),12 h后收集细胞检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路相关基因的表达情况;用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L)Arg处理牛子宫内膜上皮细胞,24 h后用CCK8法检测其对增殖率的影响,筛选出Arg的最佳作用浓度;将子宫内膜上皮细胞随机分为Arg饥饿组、Arg饥饿+IFNT处理组、Arg添加+IFNT处理组,在Arg饥饿或添加处理6 h后加入100 ng/mL IFNT,IFNT处理12 h后检测UPR通路(BiP、PERK、CHOP、ATF6)、凋亡(BAX、Caspase9)和容受性(HOXA10)相关基因表达情况。结果显示,IFNT刺激可诱导牛子宫内膜上皮细胞UPR通路相关基因BiP、PERK、CHOP、ATF6的表达显著上调;0.5 mmol/L Arg可显著提高牛子宫内膜上皮细胞的增殖率(P牛子宫内膜上皮细胞中BiP、PERK、CHOP、ATF6和BAX基因mRNA的表达(P0.05)。结果表明,Arg缺失可导致牛子宫内膜上皮细胞发生内质网应激,并影响子宫内膜宫受性的建立,可为进一步揭示Arg对牛子宫内膜的调控机制及制定减少妊娠早期胚胎丢失的营养调控策略提供参考。

关键词：精氨酸(Arg) 干扰素-tau 牛子宫内膜上皮细胞未折叠蛋白反应

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LIF调控奶牛子宫内膜上皮细胞容受性基因表达研究

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黑龙江动物繁殖 2024年第1期32卷 1-6页

作者：王红战陈艳茹李琦唐颖李博郑鹏东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030

接受态的子宫内膜对于奶牛胚胎的成功植入至关重要。为探讨白血病抑制因子(LIF)对奶牛子宫内膜容受性的调控机制,试验将奶牛子宫内膜上皮细胞分为对照组、LIF处理组、LIF+STAT3共处理组,研究了LIF对子宫内膜容受性的作用和STAT3信号通... 详细信息

接受态的子宫内膜对于奶牛胚胎的成功植入至关重要。为探讨白血病抑制因子(LIF)对奶牛子宫内膜容受性的调控机制,试验将奶牛子宫内膜上皮细胞分为对照组、LIF处理组、LIF+STAT3共处理组,研究了LIF对子宫内膜容受性的作用和STAT3信号通路对奶牛子宫内膜容受性的调控。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测容受性相关基因HOXa10、VEGF和炎症相关基因TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达变化。结果表明:与对照组相比,LIF处理组奶牛子宫内膜上皮细胞的容受性相关基因HOXa10、VEGF的表达量显著增加(P0.05);TLR4、NF-κB的表达量与LIF处理组比较无显著差异(P>0.05),显著高于对照组(P子宫内膜上皮细胞HOXa10、VEGF的表达,能够增强子宫内膜的容受性。

关键词：牛子宫内膜上皮细胞容受性胚胎附植 STAT3抑制剂白血病抑制因子(LIF)

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孕酮对脂多糖诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤的影响机制

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孕酮对脂多糖诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤的影响机制

作者：张琦扬州大学

学位级别：硕士

奶牛产后子宫感染可导致子宫内膜炎症和氧化损伤。大肠杆菌（Escherichia coli,***）是常见致病菌之一,其致病成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可造成子宫内膜氧化损伤。高水平孕酮（progesterone,P4）是诱发产后子宫感染的因素之... 详细信息

奶牛产后子宫感染可导致子宫内膜炎症和氧化损伤。大肠杆菌（Escherichia coli,***）是常见致病菌之一,其致病成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可造成子宫内膜氧化损伤。高水平孕酮（progesterone,P4）是诱发产后子宫感染的因素之一。P4已被证明抑制奶牛子宫先天免疫,并可减少神经组织氧化损伤,但孕酮对奶牛子宫内膜氧化损伤的影响尚未见报道。本研究旨在通过体外实验探讨孕酮对大肠杆菌LPS诱导的牛原代子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEEC）氧化损伤的影响及其机制,为深入揭示奶牛子宫内膜炎发生机理提供资料。（1）孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤相关因子的影响采用1μg/mLLPS诱导细胞氧化损伤,检测不同浓度孕酮（1、3和5ng/mL）对细胞氧化损伤指标和抗氧化酶活性的影响。孕酮单独处理、孕酮和LPS共处理、或孕酮受体阻断剂米非司酮（35 ng/mL）单独处理细胞12 h后,检测细胞活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力和总抗氧化能力（T-AOC）。结果:孕酮（1,3和5 ng/mL）或米非司酮（35 ng/mL）单独处理对细胞ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力以及T-AOC无明显影响（P＞0.05）;与空白对照组相比,LPS组细胞ROS 水平、MDA含量均升高（P＜0.05）,SOD和CAT活力均下降（P＜0.05）,T-AOC下降（P＜0.05）;与LPS组相比,孕酮（1或3 ng/mL）和LPS共处理组的细胞ROS水平和MDA含量均降低（P＜0.05）,SOD和CAT活力均升高（P＜0.05）,T-AOC升高（P＜0.05）。结果说明,1或3 ng/mL孕酮通过降低BEEC的ROS水平,增强抗氧化酶活力来抵御LPS诱导的氧化损伤。（2）孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞NRF2/KEAP1通路相关基因与蛋白的影响采用1μg/mL LPS诱导BEEC细胞氧化损伤的模型并观察NRF2/KEAP1通路相关因子的基因（0～36h）和蛋白表达（0～120 min）的时程变化,确定后续实验检测时间点;采用LPS和不同浓度孕酮（1、3和5ng/mL）共处理细胞,观察孕酮对BEEC NRF2/KEAP1通路的影响机制。NRF2/KEAP1通路相关因子的基因表达采用荧光定量PCR检测,蛋白水平采用Western Blot检测,利用免疫荧光技术进行NRF2核蛋白定位。结果:LPS 处理细胞 6、12 和 24 h 可引起NRF2、HMOX1、NQO1、GCLC、GSTP1和GPX2的基因表达降低（P＜0.05或P＜0.01）,KEAP1基因表达升高（P＜0.05）,因此选择6、12和24 h作为时间点进行后续实验。与LPS组相比,LPS和孕酮（1或3 ng/mL）共处理组细胞NRF2、HMOX1、NQO1、GCLC、GSTP1 及 GPX2的基因表达升高（P＜0.05或P＜0.01）,KEAP1基因表达降低（P＜0.05）;LPS和5 ng/mL孕酮共处理组的细胞整体上上述基因的变化不显著（多数P＞0.05）。LPS处理90min可引起细胞NRF2、HO-1和NQO1的蛋白水平降低（P＜0.05或P＜0.01）,KEAP1蛋白水平升高（P＜0.05）,核蛋白NRF2水平降低（P＜0.05或P＜0.01）,因此选择90 min进行后续实验。与LPS处理组相比,1或3 ng/mL孕酮和LPS共处理可导致细胞总蛋白NRF2、NQO1和HO-1的蛋白水平升高（P＜0.05或P＜0.01）,KEAP1蛋白水平下降（P＜0.05）,核蛋白NRF2水平升高（P＜0.05或P＜0.01）;与对照组相比,LPS处理细胞后,细胞核内荧光增强（P＜0.05）;与LPS处理相比,1或2 ng/mL孕酮与LPS共处理组核内荧光增强（P＜0.05或P＜0.01）。结果说明,1或3 ng/mL孕酮通过激活NRF2/KEAP1信号通路抑制了 LPS诱导的牛子宫内膜上皮细胞的氧化损伤。（3）米非司酮对孕酮抑制BEEC氧化损伤的影响机制研究为探究孕酮调节BEEC氧化损伤的机制,首先检测米非司酮（35 ng/mL）和孕酮（1、3和5 ng/mL）对孕酮受体基因（PGR）表达的影响;然后采用LPS、孕酮（3 ng/mL）和米非司酮共处理BEEC细胞,检测细胞氧化损伤标记物和NRF2/KEAP1信号通路相关蛋白与基因的表达。结果:米非司酮单独处理细胞6 h可引起PGR表达下调（P＜0.05）;5 ng/mL孕酮单独处理细胞24h,PGR表达下调（P＜0.05）,而1或3 ng/mL孕酮处理细胞,PGR表达无明显变化（P＞0.

关键词：牛子宫内膜上皮细胞孕酮氧化应激脂多糖 NRF2/KEAP1

非瑟酮对LTA诱导子宫内膜炎的炎症和氧化应激反应的研究

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非瑟酮对LTA诱导子宫内膜炎的炎症和氧化应激反应的研究

作者：沈菩秀河南农业大学

学位级别：硕士

牛子宫内膜炎是养殖中常见的生殖疾病之一,影响发情周期,降低生殖效率等。细菌感染是常见因素,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等,其中金黄色葡萄球菌会诱发亚临床或慢性子宫内膜炎。脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)存在于金黄色葡萄球... 详细信息

牛子宫内膜炎是养殖中常见的生殖疾病之一,影响发情周期,降低生殖效率等。细菌感染是常见因素,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等,其中金黄色葡萄球菌会诱发亚临床或慢性子宫内膜炎。脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)存在于金黄色葡萄球菌细胞壁中,在诱导疾病中发挥关键作用。牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEECs)是子宫内膜抵御的首要防线,在多种刺激下发生炎症反应,影响牛的生殖性能。抗生素在临床上广泛使用,但过度使用会出现耐药性、药物代谢等问题,需要寻找新的替代药物。近年来,多项研究发现非瑟酮作为一种天然黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎等生物活性,可用于防治肺炎、乳腺炎等多种疾病。基于以上所述,本研究使用BEECs构建体外模型,使用小鼠进行在体试验,研究非瑟酮对LTA诱导的炎症和氧化应激反应。具体研究内容如下:(1)牛子宫内膜上皮细胞培养与体外炎症和氧化应激模型的建立培养牛子宫内膜上皮细胞,贴壁后形态呈“铺路石样”。免疫荧光结果显示:上皮细胞角蛋白18(CK-18)表达呈阳性,细胞系纯,为后续实验奠定基础。CCK-8检测发现,LTA浓度>25μg/m L时会显著影响细胞活力;ROS水平检测、Western blot、RT-q PCR反应进一步发现:25μg/m L的LTA诱导细胞48 h后产生大量ROS,TNF-α、IL-1β表达水平显著升高。综合表明,采用浓度为25μg/m L的LTA诱导细胞48 h来构建体外细胞炎症和氧化应激模型。(2)非瑟酮对LTA诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症和氧化应激反应调控作用的研究首先用CCK-8法检测非瑟酮对细胞活力的影响,发现非瑟酮浓度≥100μg/m L时会显著降低细胞活力,试验共分6组(n=3),分别为对照组、LTA组、LTA+非瑟酮(12.5、25、50μg/m L)组、非瑟酮(50μg/m L)组,采用RT-q PCR、Western blot等方法对非瑟酮调控作用进行分析。发现不同浓度非瑟酮可抑制LTA诱导的TLR2的表达及下游NF-κB的活化,减少TNF-α、IL-1β的分泌,促进Nrf2及下游NQO1、SOD等的表达,减少ROS和MDA的积累,表明非瑟酮可缓解LTA诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症和氧化应激反应。(3)非瑟酮对LTA诱导下小鼠子宫内膜炎症和氧化损伤反应调控作用的研究使用昆明小鼠进行在体试验,采用子宫灌注法将5 mg/kg的LTA溶液注入小鼠子宫内诱导24 h,之后腹腔注射不同剂量的非瑟酮溶液(25 mg/kg和50 mg/kg)作用24 h,小鼠颈部处死,收集子宫样本。采用H(5)E染色、RT-q PCR、Western blot等方法进行样本分析。结果显示:LTA灌注后明显可见小鼠子宫肿大、缩短、内膜上皮细胞和深层结构可见较多中性粒细胞浸润;激活TLR2介导的NF-κB通路,增加MDA和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的表达。不同剂量非瑟酮处理后小鼠子宫形态逐渐恢复正常,内膜上皮细胞内中性粒细胞浸润减少;抑制NF-κB通路的活化,减少TNF-α、IL-1β的产生;促进Nrf2的表达,增加NQO1、SOD等抗氧化酶的表达水平,减少MDA的积累。综合表明,非瑟酮可缓解LTA诱导下小鼠子宫内膜炎症和氧化损伤反应。综上所述,非瑟酮可通过抑制NF-κB信号通路的活化,减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌,增加Nrf2及下游NQO1、SOD等抗氧化酶的表达,减少ROS、MDA的积累来缓解LTA诱导子宫内膜炎症和氧化应激反应。

关键词：牛子宫内膜炎牛子宫内膜上皮细胞脂磷壁酸非瑟酮氧化应激