孕酮对脂多糖诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤的影响机制

作     者：张琦 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建基

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛子宫内膜上皮细胞 孕酮 氧化应激 脂多糖 NRF2/KEAP1 

摘      要：奶牛产后子宫感染可导致子宫内膜炎症和氧化损伤。大肠杆菌（Escherichia coli,***）是常见致病菌之一,其致病成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可造成子宫内膜氧化损伤。高水平孕酮（progesterone,P4）是诱发产后子宫感染的因素之一。P4已被证明抑制奶牛子宫先天免疫,并可减少神经组织氧化损伤,但孕酮对奶牛子宫内膜氧化损伤的影响尚未见报道。本研究旨在通过体外实验探讨孕酮对大肠杆菌LPS诱导的牛原代子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEEC）氧化损伤的影响及其机制,为深入揭示奶牛子宫内膜炎发生机理提供资料。（1）孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤相关因子的影响采用1μg/mLLPS诱导细胞氧化损伤,检测不同浓度孕酮（1、3和5ng/mL）对细胞氧化损伤指标和抗氧化酶活性的影响。孕酮单独处理、孕酮和LPS共处理、或孕酮受体阻断剂米非司酮（35 ng/mL）单独处理细胞12 h后,检测细胞活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力和总抗氧化能力（T-AOC）。结果:孕酮（1,3和5 ng/mL）或米非司酮（35 ng/mL）单独处理对细胞ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力以及T-AOC无明显影响（P0.05）;与空白对照组相比,LPS组细胞ROS 水平、MDA含量均升高（P0.05）,SOD和CAT活力均下降（P0.05）,T-AOC下降（P0.05）;与LPS组相比,孕酮（1或3 ng/mL）和LPS共处理组的细胞ROS水平和MDA含量均降低（P0.05）,SOD和CAT活力均升高（P0.05）,T-AOC升高（P0.05）。结果说明,1或3 ng/mL孕酮通过降低BEEC的ROS水平,增强抗氧化酶活力来抵御LPS诱导的氧化损伤。（2）孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞NRF2/KEAP1通路相关基因与蛋白的影响采用1μg/mL LPS诱导BEEC细胞氧化损伤的模型并观察NRF2/KEAP1通路相关因子的基因（0～36h）和蛋白表达（0～120 min）的时程变化,确定后续实验检测时间点;采用LPS和不同浓度孕酮（1、3和5ng/mL）共处理细胞,观察孕酮对BEEC NRF2/KEAP1通路的影响机制。NRF2/KEAP1通路相关因子的基因表达采用荧光定量PCR检测,蛋白水平采用Western Blot检测,利用免疫荧光技术进行NRF2核蛋白定位。结果:LPS 处理细胞 6、12 和 24 h 可引起NRF2、HMOX1、NQO1、GCLC、GSTP1和GPX2的基因表达降低（P0.05或P0.01）,KEAP1基因表达升高（P0.05）,因此选择6、12和24 h作为时间点进行后续实验。与LPS组相比,LPS和孕酮（1或3 ng/mL）共处理组细胞NRF2、HMOX1、NQO1、GCLC、GSTP1 及 GPX2的基因表达升高（P0.05或P0.01）,KEAP1基因表达降低（P0.05）;LPS和5 ng/mL孕酮共处理组的细胞整体上上述基因的变化不显著（多数P0.05）。LPS处理90min可引起细胞NRF2、HO-1和NQO1的蛋白水平降低（P0.05或P0.01）,KEAP1蛋白水平升高（P0.05）,核蛋白NRF2水平降低（P0.05或P0.01）,因此选择90 min进行后续实验。与LPS处理组相比,1或3 ng/mL孕酮和LPS共处理可导致细胞总蛋白NRF2、NQO1和HO-1的蛋白水平升高（P0.05或P0.01）,KEAP1蛋白水平下降（P0.05）,核蛋白NRF2水平升高（P0.05或P0.01）;与对照组相比,LPS处理细胞后,细胞核内荧光增强（P0.05）;与LPS处理相比,1或2 ng/mL孕酮与LPS共处理组核内荧光增强（P0.05或P0.01）。结果说明,1或3 ng/mL孕酮通过激活NRF2/KEAP1信号通路抑制了 LPS诱导的牛子宫内膜上皮细胞的氧化损伤。（3）米非司酮对孕酮抑制BEEC氧化损伤的影响机制研究为探究孕酮调节BEEC氧化损伤的机制,首先检测米非司酮（35 ng/mL）和孕酮（1、3和5 ng/mL）对孕酮受体基因（PGR）表达的影响;然后采用LPS、孕酮（3 ng/mL）和米非司酮共处理BEEC细胞,检测细胞氧化损伤标记物和NRF2/KEAP1信号通路相关蛋白与基因的表达。结果:米非司酮单独处理细胞6 h可引起PGR表达下调（P0.05）;5 ng/mL孕酮单独处理细胞24h,PGR表达下调（P0.05）,而1或3 ng/mL孕酮处理细胞,PGR表达无明显变化（P0.