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牛分枝杆菌Ag85B的生物信息学分析及多表位候选抗原的构建

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黑龙江畜牧兽医 2024年

作者：董希望张岩魏稚彤李文欣刘思宇梁栋赵海涛河南农业大学动物科技学院河南省鲁山县畜牧技术推广站

为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以p ET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的... 详细信息

为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以p ET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的理化性质、抗原性并进行免疫模拟。结果表明:Ag85B蛋白有325个氨基酸残基,相对分子量为34.580 85,理论等电点为5.62,脂肪系数为72.18,亚细胞定位于线粒体、细胞质和高尔基体中,具有亲水性、信号肽和跨膜结构域,属于分泌型蛋白,其无规则卷曲和β-转角结构的占比分别28.15%和8.62%,含有3个T淋巴细胞优势表位和8个B淋巴细胞优势表位。构建的Ag85B多表位候选抗原为亲水性蛋白和非致敏原,两次预测免疫原性参数分别为0.893和1.524,可诱导特异性的体液和细胞免疫应答。说明试验成功构建出基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,且该多表位候选抗原可能诱导机体产生T、B淋巴细胞免疫应答。

关键词：牛分枝杆菌抗原表位 Ag85B 生物信息学多表位候选抗原

牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

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中国预防兽医学报 2023年第7期45卷 729-736页

作者：梁秋韵孟祥苗杨可黄蓓宋厚辉杨杨浙江农林大学动物科技学院/动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室浙江杭州311300

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M.bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从M.bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将... 详细信息

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M.bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从M.bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中,并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示,重组菌株中出现约55 ku的特异性条带,表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS_Mb0869c。将MS_Mb0869c株和对照菌株MS_Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色,经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示,MS_Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS_Vec感染组,这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显示,构建的HEK293T细胞中出现约55 ku的特异性条带,且随着细胞传代次数的增加,蛋白表达量未减少,这表明稳定表达Mb0869c的细胞系HEK293T/Mb0869c正确构建。利用不同浓度的肿瘤坏死因子α (TNF-α)和IAP抑制剂(SM164)作用于HEK293T细胞,通过检测细胞内ATP的含量确定细胞凋亡发生情况。结果显示,100 ng/mL TNF-α和25 nmol/L SM164在作用细胞24 h后,诱导细胞凋亡的效果最佳。以该浓度分别作用于HEK293T/Mb0869c和对照组HEK293T/Con细胞24 h后,统计细胞的存活率。结果显示前者的存活率极显著高于后者(P<0.01),表明Mb0869c能够抑制细胞凋亡。通过PCR扩增人RIPK1的3个结构域片段,并分别克隆至p CMV-Myc中构建真核表达重组质粒并经菌落PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T/Mb0869c细胞,通过免疫共沉淀法(Co-IP)检测RIPK1结构域与Mb0869c的互作。结果显示Mb0869c和RIPK1的激酶结构域(KD)和中间结构域(ID)存在相互作用。上述结果表明,Mb0869c蛋白在M.bovis抑制细胞凋亡中具有重要的作用,且这种抑制作用是通过RIPK1实现的。本研究为M.bovis蛋白通过RIPK1调节细胞凋亡作用机制的研究提供实验依据。

关键词：牛分枝杆菌细胞凋亡 Mb0869c 受体相互作用蛋白激酶1

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牛分枝杆菌肉芽肿形成机理的研究进展

畜牧与兽医 2023年第8期55卷 119-125页

作者：于有利黎玉琼薛峰宁夏农林科学院动物科学研究所宁夏银川750002 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

牛结核病(bovine tuberculosis, bTB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病。bTB的发展和转归是宿主的免疫系统和牛分枝杆菌相互斗争的结果,这种斗争最基本和最主要的病理特征之一是形成肉芽肿。因此,阐... 详细信息

牛结核病(bovine tuberculosis, bTB)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病。bTB的发展和转归是宿主的免疫系统和牛分枝杆菌相互斗争的结果,这种斗争最基本和最主要的病理特征之一是形成肉芽肿。因此,阐明肉芽肿的形态特点及参与肉芽肿形成的因素,揭示肉芽肿形成的动态过程,对于了解结核病的发生发展规律,以及研发新的抗结核药物具有重大意义。本文对牛结核肉芽肿的特点、功能以及参与牛结核肉芽肿形成的各种因素进行了综述。

关键词：牛结核病牛分枝杆菌肉芽肿

牛分枝杆菌CVCC68002全基因组测序与功能分析

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甘肃农业大学学报 2023年第5期58卷 11-24页

作者：王霞马伟超雒林通裴芳王廷璞天水师范学院生物工程与技术学院甘肃天水741001 天水市第五人民医院检验科甘肃天水741024

【目的】为进一步深入研究牛分枝杆菌CVCC68002基因组特征,致病性和遗传进化关系,为牛分支杆菌感染疾病的预防和深入研究提供参考。【方法】利用Illumina和Pacbio测序技术平台对CVCC68002菌株进行全基因组测序建库,采用生物信息学和系... 详细信息

【目的】为进一步深入研究牛分枝杆菌CVCC68002基因组特征,致病性和遗传进化关系,为牛分支杆菌感染疾病的预防和深入研究提供参考。【方法】利用Illumina和Pacbio测序技术平台对CVCC68002菌株进行全基因组测序建库,采用生物信息学和系统进化树等方法,对该菌株基因组功能注释、致病性和遗传进化关系进行了分析。【结果】通过分析发现该菌株基因组全长4357100 bp,GC含量为65.64%,编码基因达4145个;在GO、KEGG、COG、NR数据库基因组特征显示其具有高氨基酸和碳水化合物代谢能力。通过PHI,VFDB,ARDC和CARD数据库对其致病性进行相关分析,得到456个毒力基因注释,主要涉及细菌黏附与定殖、细菌逃避宿主免疫防御系统、分泌系统蛋白和转录因子等。并找到相关包括万古霉素,青霉素,多胺类抗生素、异烟肼、吡嗪酰胺、氟喹诺酮等的抗药性基因,另外,外排泵的抗性蛋白注释量显著,推测牛分枝杆菌通过外排抗性蛋白从而达到抗药自我保护的目的。【结论】获得牛分枝杆菌CVCC68002株完整基因组信息,完善系统进化信息,明确了其毒力因子和有效地靶标抗药基因,为后续对该菌株分子生物学特征、致病性和耐药基因筛选研究奠定了理论基础。

关键词：牛分枝杆菌基因组测序致病性分析毒力因子耐药性分析

鸟苷酸结合蛋白5在牛分枝杆菌诱导巨噬细胞极化过程中的作用

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微生物学通报 2023年第3期50卷 1163-1178页

作者：刘梦婷于有利潘家良黄群涛王洪生任建鸾汤芳戴建君薛峰南京农业大学动物医学院江苏南京210095 宁夏农林科学院动物科学研究所宁夏银川750002 中国医学科学院皮肤病研究所江苏南京210042 中国药科大学江苏南京211198

【背景】牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是重要的人畜共患病原体,严重危害公共卫生安全。巨噬细胞是牛分枝杆菌感染的主要效应细胞,M1型巨噬细胞极化对于宿主免疫防御M. bovis感染至关重要。【目的】探讨鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-bi... 详细信息

【背景】牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是重要的人畜共患病原体,严重危害公共卫生安全。巨噬细胞是牛分枝杆菌感染的主要效应细胞,M1型巨噬细胞极化对于宿主免疫防御M. bovis感染至关重要。【目的】探讨鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5, GBP5)对M. bovis感染的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞M1、M2型极化的影响,以及GBP5在M. bovis感染中的作用。【方法】通过前期转录组学数据分析筛选出差异基因GBP5,通过体内、体外验证M. bovis感染后的GBP5的表达水平。小干扰RNA下调细胞内GBP5表达,分别利用RT-q PCR、Western blotting和流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞表面标志物表达变化;平板菌落计数法检测GBP5对M. bovis在巨噬细胞中复制的影响;双荧光素酶报告基因试验检测GBP5对信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)转录调控;Western blotting检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制后STAT3的磷酸化情况。【结果】GBP5在M. bovis感染的RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠组织中表达增加;下调GBP5后细胞内细菌CFU在感染后不同时间点均显著增加,ROS释放减少,M1型巨噬细胞表面标志物表达减少,但是对M2型巨噬细胞无显著影响;下调GBP5后抑制了STAT3的转录启动。ROS的产生抑制了STAT3的磷酸化。【结论】GBP5促进ROS的产生,调控ROS/STAT3通路,促进巨噬细胞向M1型极化,从而抑制细胞内牛分枝杆菌的存活。

关键词：鸟苷酸结合蛋白5 巨噬细胞极化牛分枝杆菌

4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价

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畜牧与兽医 2023年第12期55卷 55-61页

作者：辛凌翔王豪杰刘燕姚文生胡云皓张一帜赵浩然鑫婷朱良全中国兽医药品监察所北京100081 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100081

牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和M... 详细信息

牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物,通过温度梯度PCR法确定最适退火温度;采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限,同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验;最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌,其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高,可达10^(-10) ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达10~6 CFU/mL以上,而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10~2 CFU/mL。本研究筛选出相对适宜的牛分枝杆菌PCR检测方法,为牛结核病病原学检测和临床应用提供技术支持。

关键词：牛分枝杆菌病原 PCR 灵敏度特异性

牛分枝杆菌MPB63基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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生物化学与生物物理进展 2005年第2期32卷 129-132页

作者：姜秀云王春凤王春芳何昭阳吉林农业大学生物技术学院吉林农业大学动物科技学院长春130118 吉林农业大学动物科技学院

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB63成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约400 bp的DNA片段. 通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-63. 以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-63和pET28... 详细信息

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB63成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约400 bp的DNA片段. 通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-63. 以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-63和pET28a(+),并将纯化的MPB63基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达载体pET28a-63. 将pET28a-63转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见约18 ku外源蛋白带. 蛋白质印迹分析发现,该蛋白质具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB63的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.

关键词：牛分枝杆菌 MPB63基因克隆原核表达

基于3种抗原的融合表达蛋白建立牛分枝杆菌抗体ELISA检测方法

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畜牧与兽医 2022年第5期54卷 121-127页

作者：潘家良于有利刘梦婷单玉平汤芳任建鸾薛青红薛峰戴建君南京农业大学动物医学院江苏南京210095 连云港市畜牧兽医站江苏连云港222000 中国兽医药品监察所北京100081

为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至... 详细信息

为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:通过SDSPAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。

关键词：牛分枝杆菌诊断抗原 Rv3403c CFP10 ESAT6 融合表达间接ELISA

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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微生物学报 2005年第2期45卷 298-300页

作者：姜秀云王春凤王春芳何昭阳吉林农业大学生物技术学院长春130118 吉林农业大学动物科技学院长春130118

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以MPB5 1成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得约80 0bp的DNA片段。通过T- A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM TVector中 ,成功地构建出克隆质粒pGEM T -5 1。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM T- ... 详细信息

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以MPB5 1成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得约80 0bp的DNA片段。通过T- A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM TVector中 ,成功地构建出克隆质粒pGEM T -5 1。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM T- 5 1和pET2 8a(+) ,并将纯化的MPB5 1基因亚克隆至pET2 8a (+)中 ,构建出原核表达质粒pET2 8a- 5 1。将pET2 8a- 5 1转化至感受态E .coliBL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导和SDS PAGE分析 ,可见约30kD外源蛋白带。Westernblot分析发现 ,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性 ,从而为进一步研究MPB5 1的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。

关键词：牛分枝杆菌 MPB51基因克隆原核表达