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牛凝乳酶的结晶及其二硫键的化学修饰

生物工程学报 1991年第1期7卷 77-83页

作者：黄葵陈世芝杨开宇中国科学院微生物研究所中国科学院生物物理研究所

为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg/ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃... 详细信息

为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg/ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃1.4—2.0mol/L氯化钠条件下进行培养可以获得外形近似为正立方体晶体。化学修饰的结果证明,凝乳酶的三对二硫键处于酶分子不同的空间部位。0.72mmol/L DTT在pH6.3条件下能还原处于分子表面的一对二硫键,经溴化氰降解分肽测定为Cys^(250)-Cys^(283),还原后引起活力下降25%。在二硫键之间引入汞原子其活力与还原酶,羧甲基化酶的活力大体相同,说明Cys^(250)-Cys^(283)在维持凝乳酶具有活力的空间构象中起着一定的作用。

关键词：牛凝乳酶二硫键化学修饰

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

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食品工业科技 2014年第15期35卷 188-192页

作者：杨艺普燕张富春新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源与基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin，B—chy），用电脉冲法将线性化的pGAPZctA—B—pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS—PAGE分析表明... 详细信息

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶（chymosin，B—chy），用电脉冲法将线性化的pGAPZctA—B—pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS—PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶，分子量约为37ku，符合预期大小。发酵培养96h后，酶活力达到96SU／mL。酶学特性分析表明，其最适凝乳温度为60℃，在pH2～6、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2＋浓度为40mmol／L时，钙促酶反应活性达到最高，此后随着Ca2＋浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3＋、Mn2＋、Fe2＋、Mg2＋和K＋对酶活力具有显著的促进作用，而Co2＋、Zn2＋、Cu2＋、Ni＋对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件，为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。

关键词：牛凝乳酶毕赤酵母分泌表达酶学特性金属离子

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牛凝乳酶基因的克隆与表达

中国乳品工业 2008年第10期36卷 8-12页

作者：王景会姜媛媛李启云张莉徐波李达杨贞耐中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心长春130124

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒pTWIN1/EchybF2。经转化... 详细信息

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒pTWIN1/EchybF2。经转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下进行凝乳酶的表达。SDS-PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示,CBD-intein-EchybF2融合蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在,并具有凝乳活性。

关键词：牛凝乳酶克隆表达

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牛凝乳酶在毕赤酵母系统中表达及其性质研究

牛凝乳酶在毕赤酵母系统中表达及其性质研究

作者：冷欢湖北大学

学位级别：硕士

牛凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶。它特异性切断牛乳中K-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键,引起牛乳凝结反应。凝乳酶在奶酪的生产中应用广泛,它的主要作用是使牛乳凝结并改善其口味。根据凝乳酶的来源不同可... 详细信息

牛凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶。它特异性切断牛乳中K-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键,引起牛乳凝结反应。凝乳酶在奶酪的生产中应用广泛,它的主要作用是使牛乳凝结并改善其口味。根据凝乳酶的来源不同可将凝乳酶分为四类：动物性凝乳酶,植物性凝乳酶,微生物凝乳酶以及基因工程凝乳酶。基因工程凝乳酶与其他来源凝乳酶相比,生产成本低,来源稳定。本研究首先利用PCR扩增凝乳酶原基因片段,用EcoR Ⅰ与Not I分别酶切该基因片段并与相同酶切后的pPIC9K连接,将牛凝乳酶原基因克隆到pPIC9K酵母表达载体中,经过酶切和测序方法证明pPIC9K-prochy重组子成功构建。用电脉冲法将经过Sal I线性化的重组质粒转化到毕赤酵母GS115及KM71宿主菌中。转化子在28℃,MD营养缺陷型培养基中培养2-3天后进行筛选重组菌株,最后采用摇瓶诱导的方法收集上清液,将上清液酸化至pH2.0静置两小时调至pH6.0后采用Arima K酶活测定的方法筛选出酶活相对较高的重组菌株。本实验从160株GS115-pPIC9K-prochy和160株KM71-pPIC9K-prochy重组菌株中分别筛选出一株酶活相对最高为25.0SU/mL和11.5SU/mL的重组菌株,分别将这两株重组菌株命名为：GS115-pPIC9K-prochy-32和KM71-pPIC9K-prochy-21。这两株重组菌株均分泌表达牛凝乳酶原蛋白,经SDS-PAGE实验后分析得到牛凝乳酶原条带的分子量约为44KDa,比预期的凝乳酶原略大。通过Arima K方法酸化处理后的凝乳酶原进行酶活测试并比较两种不同的毕赤酵母表达的牛凝乳酶的酶学性质,发现由GS115-pPIC9K-prochy-32表达的凝乳酶的酶活比KM71-pPIC9K-prochy-21表达的牛凝乳酶的酶活高出一倍,而且前者的稳定性要高于后者,50℃处理50min后,前者仍可保留66.7%的酶活,而后者酶活为0。两者有相同的最适温度50℃,最适pH5.7,60℃热处理20min活性全部丧失。将GS115-pPIC9K-prochy-32和KM71-pPIC9K-prochy-21两株重组菌株优化诱导培养条件,甲醇诱导228h后去上清粗酶液,在最适温度50℃及pH5.7下测得GS115-pPIC9K-prochy-32上清液的粗酶活为317SU/mL, KM71-pPIC9K-prochy-21上清液的粗酶活为180SU/mL。

关键词：牛凝乳酶毕赤酵母酶学性质

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牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质研究

牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质研究

作者：袁伟河南师范大学

学位级别：硕士

凝乳酶是酸性蛋白酶,它是组成皱胃酶的一种主要成分,在反刍动物的第四胃产生凝乳酶原,主要是水解Κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106键。凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,在奶酪生产过程中,它起着凝结牛乳、改善风味的作用。为获得高活性的凝乳酶制... 详细信息

凝乳酶是酸性蛋白酶,它是组成皱胃酶的一种主要成分,在反刍动物的第四胃产生凝乳酶原,主要是水解Κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106键。凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,在奶酪生产过程中,它起着凝结牛乳、改善风味的作用。为获得高活性的凝乳酶制剂,本研究通过PCR技术从克隆载pUC18-preprochymosin上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pKLAC1中,构建表达质粒pKLAC1-prochymosin,通过电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中,乳酸克鲁维酵母GG799菌株非常适合于牛凝乳酶基因的表达。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌pc 7-7。该菌株分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41 kDa,符合预期大小,酸化处理后为36 kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96 h后,酶活最高达到99.67 SU/mL,这为后续的研究提供了基础。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。采用定点突变的方法来改变凝乳酶基因的碱基,此方法是依据定点突变试剂盒的方法改良而来,抽提含有凝乳酶基因的质粒载体pKLAC1-prochymosin,体外合成突变引物,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,将消化产物转化大肠杆菌JM109,随机挑选克隆进行测序和筛选、鉴定所需突变株。通过YCB和YEPDL培养基的筛选,筛选出了五个适合的突变体菌株。我们可以发现,所有的突变体都可以产生凝乳酶,但是突变体所产凝乳酶的活性较重组菌株的酶活性低,这表明此位点的改变可能对凝乳酶的折叠影响较小,但是对催化活性的影响较大。通过结构分析发现本研究所克隆出的凝乳酶为B型,判断的标准为成熟凝乳酶在224位的氨基酸,A型凝乳酶在224位的氨基酸为天冬氨酸,B型凝乳酶在224位的氨基酸为甘氨酸。氨基酸位点的改变对B型凝乳酶的活性影响较大,突变体mpc 3-7的333位氨基酸由天冬酰胺变为亮氨酸,334位的组氨酸变为异亮氨酸,从而导致酶活性的下降,而且突变体mpc 3-7的最适温度由55℃下降到50℃。说明凝乳酶的333位和334位的氨基酸的改变会影响酶的活性和热稳定性,但是对酸碱的敏感性没有改变。发酵液通过50%乙醇沉淀,Sephadex G-75分子筛层析和DEAE-52纤维素离子交换层析进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE电泳鉴定为单一的条带,已经达到电泳纯。重组凝乳酶和突变体所产凝乳酶在DEAE-52上的行为基本一致。重组菌株pc 7-7的比活力从粗酶液的114.56 U/mg提高到1609.66 U/mg,突变体菌株mpc 2-1a的比活力从粗酶液的54.2 U/mg提高到724.57 U/mg,突变体菌株mpc 3-7的比活力从粗酶液的37.05 U/mg提高到566.29 U/mg,各菌株都取得了较好的的纯化效果。通过对酶性质的研究发现,重组菌株pc 7-7的最适反应温度范围为30-55℃,最适pH范围为4.0-5.5,其Km和Vmax分别是0.02 mg/ml和0.0214 mg/***;突变菌株mpc 2-1a的最适pH为4.5,最适温度为55℃,在此条件下,酶活性能达到最高;其Km和Vmax分别是0.0122 mg/ml和0.002 mg/***;突变菌株mpc 3-7的最适pH与重组菌株相同,最适反应温度为50℃,比正常菌株pc 7-7和突变体菌株mpc 2-1a的温度有所下降,其Km和Vmax分别是0.003 mg/ml和0.0005 mg/***。

关键词：牛凝乳酶乳酸克鲁维酵母定点突变牛凝乳酶纯化酶学特性

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干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展

食品与发酵工业 2015年第5期41卷 227-234页

作者：普燕张富春新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046

牛凝乳酶具有高凝乳活性和低非特异蛋白水解活性而广泛用于干酪制备。随着干酪市场的逐年增长,牛凝乳酶出现供不应求,其替代品应运而生,包括其他动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、重组凝乳酶。在这些替代品中,重组牛凝乳酶显示出... 详细信息

牛凝乳酶具有高凝乳活性和低非特异蛋白水解活性而广泛用于干酪制备。随着干酪市场的逐年增长,牛凝乳酶出现供不应求,其替代品应运而生,包括其他动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、重组凝乳酶。在这些替代品中,重组牛凝乳酶显示出与天然牛凝乳酶相似的酶学特性,并且纯度更高,制作的干酪品质更好。目前已经有重组牛凝乳酶上市出售,成功替代了天然牛凝乳酶,但关于提高重组牛凝乳酶表达量与催化活性的研究远未止步。文中主要综述了凝乳酶结构、牛凝乳酶的替代品和重组凝乳酶的研究进展,详细综述了一些提高重组牛凝乳酶的表达方法,为外源蛋白在宿主中的高水平表达提供了有效参考。

关键词：牛凝乳酶重组凝乳酶表达量外源蛋白干酪

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重组乳酸克鲁维酵母发酵制取牛凝乳酶

重组乳酸克鲁维酵母发酵制取牛凝乳酶

作者：徐龙龙南阳师范学院

学位级别：硕士

凝乳酶具有独特的凝乳特性,在食品和医药工业中具有广泛的应用价值。近年来,凝乳酶的供应日渐不足,使其替代品得到大力发展,通过基因工程技术制取重组凝乳酶已成为凝乳酶生产的新方向。尽管凝乳酶已在干酪和医药行业中得到应用,但其大... 详细信息

凝乳酶具有独特的凝乳特性,在食品和医药工业中具有广泛的应用价值。近年来,凝乳酶的供应日渐不足,使其替代品得到大力发展,通过基因工程技术制取重组凝乳酶已成为凝乳酶生产的新方向。尽管凝乳酶已在干酪和医药行业中得到应用,但其大规模工业化生产还存在许多问题,如：凝乳酶的单位产量较低、纯化工艺复杂与应用成本高等。其中重组牛凝乳酶因其酶学性质好、可胞外分泌、商业化应用多和表达水平高等特点,被本文选为研究对象。为提高重组凝乳酶在乳酸克鲁维酵母GG799中的表达与分泌,本研究将经过密码子优化后全长1095 bp的牛凝乳酶原基因插入到乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl,构建重组表达载体Bchymo290-1。用电脉冲法将经Sac Ⅱ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞中。通过对近3000株重组子的筛选与鉴定,筛选出产酶活力相对较高的菌株bPC-1、bPC-2、bPC-3、bPC-4、为了进一步提高重组菌株bPC-1生产重组凝乳酶的能力,利用响应面法优化重组菌株bPC-1发酵培养基。Placktt-Burman实验设计筛选出影响重组凝乳酶活力的显著因子：葡萄糖浓度、玉米浆浓度、酵母粉浓度。以最陡爬坡实验所确定的中心点作为Box-Behnken实验的中心点进行响应面分析,得到优化的发酵培养基：葡萄糖46.8 g/L、玉米浆28.7 g/L、酵母粉7.5 g/L。对回归模型进行验证,重组菌株bPC-1在优化发酵的条件下凝乳酶酶活448.62 SU/mL,比优化前提高了22.65%。利用1L四联体发酵罐对重组菌株bPC-1发酵工艺参数***进行优化。设置pH4.0、pH5.0、pH6.0和自然pH四组实验,发酵后测得自然pH下凝乳酶活力值最高达到571.43 SU/mL。因此,发酵过程pH可保持自然发酵状态下的pH。设置DO参数为20%、30%、40%、50%四个梯度,发酵60 h后测得DO参数维持在40%时比其他实验组最终的凝乳酶活力值高,酶活最高达到648.65 SU/mL。因此,发酵过程中DO参数可以控制在40%。在优化发酵工艺条件下,重组菌株bPC-1在5L发酵罐扩大培养,发酵66 h时最大重组凝乳酶酶活达到700 SU/mL,较摇瓶发酵结果高出56%。5L发酵罐扩大培养所获得的上清液经酸化后,选用10kDa、50kDa孔径大小的超滤膜,对上清液进行浓缩与纯化。超滤前100 mL粗酶液含凝乳酶总活力值70000 SU,经浓缩、纯化后,回收浓缩液10 mL,总活力值为54857 SU,重组凝乳酶回收率达到78.36%。综上所述,本研究通过基因工程方法成功开发了一种产量高、可胞外分泌、后续纯化简单、生产过程安全和酶学性质好的新型凝乳酶,研究结果为开发小牛凝乳酶的替代品提供了一种新的方法,为重组凝乳酶在食品等工业上的进一步大规模应用奠定基础。

关键词：乳酸克鲁维酵母牛凝乳酶响应面法分析高密度发酵蛋白超滤

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牛凝乳酶基因的克隆与表达

农产食品科技 2009年第1期3卷 41-45页

作者：王景会姜媛媛李启云张莉徐波杨贞耐中国农业科技东北创新中心吉林省农科院农产品加工研究中心吉林长春130033

为了获得重组的凝乳酶，本研究首先提取了小牛皱胃总RNA，通过RT—PCR的方法得到了凝乳酶的cDNA。然后，构建了原核表达载体pTWIN1／chy，并将该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下表达重组凝乳酶蛋白。SDS—PAGE电泳分析和酶... 详细信息

为了获得重组的凝乳酶，本研究首先提取了小牛皱胃总RNA，通过RT—PCR的方法得到了凝乳酶的cDNA。然后，构建了原核表达载体pTWIN1／chy，并将该质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下表达重组凝乳酶蛋白。SDS—PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示，目的蛋白在BL21（DE3）中获得高效表达，并具有凝乳活性。

关键词：牛凝乳酶克隆表达

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牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

湖北大学学报（自然科学版） 2014年第3期36卷 262-266页

作者：冷欢张幸刘家书赵勇李谞江正兵宋慧婷湖北省工业生物技术重点实验室(湖北大学) 湖北武汉430062 湖北大学资源环境学院湖北武汉430062

构建3株表达凝乳酶的重组毕赤酵母，通过甲醇诱导收集BMMY液体培养基上清后，通过ArimaK方法分别对其进行酶活测试并进行酶学性质分析，结果表明，GS115／pPICgK-chyl菌株诱导7d后，其酶活达到1.905 SU/mL重组凝乳酶的最适反应温度为45... 详细信息

构建3株表达凝乳酶的重组毕赤酵母，通过甲醇诱导收集BMMY液体培养基上清后，通过ArimaK方法分别对其进行酶活测试并进行酶学性质分析，结果表明，GS115／pPICgK-chyl菌株诱导7d后，其酶活达到1.905 SU/mL重组凝乳酶的最适反应温度为45℃；最适反应pH为6；存pH4-7之间凝乳活性相对稳定；在50℃以下可以保持酶活，在55℃、处理50min后，丧欠60％的活性．

关键词：巴斯德毕赤酵母牛凝乳酶基因表达凝乳酶性质