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牙鲆amhr2基因的分子特征及组织表达

水产科学 2024年第4期43卷 509-519页

作者：张发扬李坤汪惟超张丹丹付晓娜刘翠张俊玲上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海201306 上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海201306 上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心上海201306

为探讨牙鲆AMH受体AMHR2的分子特征及其在性腺发育中的作用,采用分子克隆和生物信息学方法克隆鉴定了牙鲆amhr2基因,通过半定量PCR和实时荧光定量PCR以及化学原位杂交技术测定了amhr2基因在牙鲆不同组织中的表达谱。试验结果显示:通过... 详细信息

为探讨牙鲆AMH受体AMHR2的分子特征及其在性腺发育中的作用,采用分子克隆和生物信息学方法克隆鉴定了牙鲆amhr2基因,通过半定量PCR和实时荧光定量PCR以及化学原位杂交技术测定了amhr2基因在牙鲆不同组织中的表达谱。试验结果显示:通过克隆验证拼接得到的牙鲆amhr2 cDNA序列其开放阅读框长为1536 bp,编码511个氨基酸;牙鲆AMHR2蛋白的近N-端含有长度为19个氨基酸(1~19位氨基酸)的信号肽结构,氨基酸序列对比发现其与狭鳞庸鲽的相似度最高,为89.96%;进化树分析得出,AMHR2牙鲆在进化上与狭鳞庸鲽、大菱鲆的亲缘关系最近,进化地位相一致,说明牙鲆amhr2基因与其他物种具有一定的保守性;定量结果显示,amhr2基因主要在牙鲆卵巢与精巢中表达,且在卵巢中的表达水平显著高于精巢;原位杂交结果表明,amhr2基因主要在牙鲆支持细胞、精巢初级精母细胞以及次级精母细胞中表达,并在卵巢间质细胞、Ⅱ~Ⅴ期卵母细胞以及卵泡膜中表达。牙鲆AMHR2氨基酸序列与狭鳞庸鲽亲缘关系最近,amhr2基因主要在性腺组织中表达,且在牙鲆精巢和卵巢的生殖细胞和体细胞中均有表达,可能在牙鲆的性腺发育中有重要的调控作用。

关键词：牙鲆 amhr2基因 amh基因性腺发育

牙鲆（Paralichthys olivaceus）钙网蛋白和血清淀粉样蛋白P成分的抗菌功能研究

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牙鲆（Paralichthys olivaceus）钙网蛋白和血清淀粉样蛋白P成分...

作者：孙佳琪烟台大学

学位级别：硕士

牙鲆(Paralichthys olivaceus),作为中国海水养殖业的关键经济品种之一,但是在养殖过程中频繁遭受病害问题的困扰,这给养殖业带来了巨大的经济损失。当前,滥用抗生素等水产药物的现象日趋严重,这不仅威胁到水产品的食品安全,更损害了其... 详细信息

牙鲆(Paralichthys olivaceus),作为中国海水养殖业的关键经济品种之一,但是在养殖过程中频繁遭受病害问题的困扰,这给养殖业带来了巨大的经济损失。当前,滥用抗生素等水产药物的现象日趋严重,这不仅威胁到水产品的食品安全,更损害了其市场声誉。为了解决这些困扰,本研究从牙鲆先天免疫系统的角度出发,探索切实可行的解决方案。凝集素所介导的蛋白质与碳水化合物之间的相互作用,对于脊椎动物和无脊椎动物的先天免疫至关重要。这种相互作用不仅有助于识别潜在的病原体,还进一步参与到下游的效应功能中,包括凝集、固定、补体介导的调理和杀伤作用。通过这些机制,凝集素在维护生物体的健康与稳定中发挥着不可或缺的作用。钙网蛋白(Calreticulin,Crt)和血清淀粉样蛋白P成分(Serum amyloid P component,SAP)是两种不同类型的凝集素。其中,Crt是一种保守的凝集素样多效蛋白,而SAP则是正五聚蛋白家族的一员,在哺乳动物的免疫反应中,这两种成分都发挥着至关重要的作用。因此,本文中主要研究牙鲆中Crt和SAP两种蛋白抗菌防御功能,研究内容如下:在牙鲆中存在两种Crts,即PoCrt-1和PoCrt-2。PoCrt-1和PoCrt-2分别由419和427个氨基酸残基组成,总序列相同度为69.09%。PoCrt-1和PoCrt-2都含有一个信号肽和三个功能域,即N、P和C结构域。PoCrt-1和PoCrt-2均在不同组织中呈组成型表达,在肝脏中表达水平最高,并显著地受迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,***)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,***)调控。此外,重组PoCrt-1和PoCrt-2(r PoCrt-1和r PoCrt-2)可与不同的革兰氏阴性菌结合,其中与***的结合指数最高。同时,体外实验表明r PoCrt-1和r PoCrt-2能凝集***、***和鳗弧菌(Vibrio anguillarum,***,抑制细菌生长。同样,体内r PoCrt-1和r PoCrt-2也能显著抑制***的增殖。以上结果为牙鲆中Crt的抗菌免疫作用提供了新的视角。牙鲆SAP(Po SAP)含有215个氨基酸。Po SAP与其他鱼类SAP序列相似性为55.6～76.1%。系统进化树分析显示,Po SAP与大菱鲆(Scophthalmus maximus)的SAP在进化上的关系最为接近。Po SAP的m RNA在多种组织中广泛的表达,而且在脾脏中的表达量尤为显著;当受到细菌刺激后,Po SAP在不同组织中的表达模式则展现出差异性。重组Po SAP(r Po SAP)能够结合8种不同的细菌。在体外环境中,r Po SAP展现出对多种细菌的抑制生长能力,另外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens,***)具有显著的凝集作用,可直接杀死***。r Po SAP能够促进血清溶血和杀菌,并且能与牙鲆的补体因子C1q-A链和C1q-C链相互作用。细胞实验表明,r Po SAP能与外周血白细胞(PBLs)结合,并可提高PBLs的吞噬活性、趋化活性、细胞增殖能力、免疫相关基因表达、呼吸爆发和抗细菌感染能力。此外,r Po SAP不仅具备诱导中性粒细胞释放胞外陷阱(NETs)的能力,而且在鱼体内,它显著增强了宿主对入侵细菌的清除能力。综上所述,r Po SAP能够单独、以及提高血清、白细胞的活性而发挥抗菌作用。总而言之,本实验创新性的发现牙鲆PoCrt-1/PoCrt-2和Po SAP无论在体外还是体内都具有显著的免疫抗菌功能,这将填补牙鲆Crts和SAP免疫抗菌功能的理论空白,加深鱼类凝集素相关蛋白的认识,从而为鱼类病害的绿色高效防控提供坚实的理论基础。

关键词：牙鲆钙网蛋白-1/2 血清淀粉样蛋白P成分抗菌功能先天免疫

牙鲆foxl3的分子特征、亚细胞定位及组织表达

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中国水产科学 2023年第4期30卷 406-414页

作者：武宁宁刘翠汪惟超张俊玲上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海海洋大学国家海洋生物科学国际联合研究中心

为明确牙鲆(Paralichthys olivaceus)foxl3的结构和功能,通过PCR克隆和测序获得了牙鲆foxl3的编码区(coding sequence, CDS)和3’非编码区(untranslated region, UTR),共1089 bp,其中开放阅读框(open reanding frame,ORF) 750 bp,编码249个氨基酸。Foxl3二级结构包含一个FH (Forkhead)结构域;三级结构则包含20.48%的α螺旋、15.26%的延伸链和64.26%的无规则卷曲,不均匀分布在蛋白多肽链上。比较多种生物Foxl3氨基酸序列发现,牙鲆Foxl3与其他鱼类相似度较高,其中与大菱鲆(Scophthalmus maximus)同源性最高,达到91.97%,与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最低,仅为66.27%。通过氨基酸序列比对发现,与Foxl2相比, Foxl3在不同物种之间的差异更为显著,说明foxl3的进化速度比foxl2快。亚细胞定位显示,Foxl3细胞融合蛋白在细胞核和细胞质中表达。实时荧光定量PCR检测结果显示foxl3在牙鲆卵巢中表达量最高,显著高于精巢等其他组织,暗示foxl3可能在牙鲆卵巢发育与分化中具有重要意义。

关键词：牙鲆 foxl3 分子特征亚细胞定位组织表达

促卵泡激素对牙鲆尾部神经分泌系统活动的影响

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水产学报 2022年第1期46卷 10-19页

作者：江鹏鑫潘歆蓓吕为群上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室上海海洋大学海洋生物科学国际联合研究中心(中国科学技术部)

为探究促卵泡激素(FSH)是否参与调控鱼类特有的尾部神经分泌系统(CNSS)活动,实验利用电生理技术检测FSH是否影响dahlgren细胞放电活动。此外,利用PCR技术检测离体的CNSS在FSH急性灌流后和繁殖季节CNSS主要的相关基因的表达。结果显示,FS... 详细信息

为探究促卵泡激素(FSH)是否参与调控鱼类特有的尾部神经分泌系统(CNSS)活动,实验利用电生理技术检测FSH是否影响dahlgren细胞放电活动。此外,利用PCR技术检测离体的CNSS在FSH急性灌流后和繁殖季节CNSS主要的相关基因的表达。结果显示,FSH促进dahlgren细胞放电频率和诱导部分细胞静止型放电转向爆发型放电。促卵泡激素受体结合抑制剂(FRBI-8)能够阻断FSH对dahlgren细胞放电活动的影响。FSH灌流后,CNSS中FSH受体基因(fshr)的表达量无显著变化,而L型电压门控钙离子通道基因(LCa2+)的表达量显著上调。在繁殖季节,脑垂体中fshβ的表达量和性腺指数(GSI)或CNSS中的尾加压素Ⅱ基因(UⅡ)的表达量呈显著的正相关。本研究首次证明FSH能够调控CNSS,这为进一步解析CNSS在生殖和季节适应中的作用奠定基础。

关键词：牙鲆尾部神经分泌系统神经调节促卵泡激素尾加压素Ⅱ

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基于稳定同位素技术的增殖放流牙鲆群体鉴别

应用生态学报 2022年第1期33卷 261-267页

作者：王青林于姗姗靳晓敏任建功司飞孙桂清孙朝徽白曾齐河北科技师范学院海洋资源与环境学院河北秦皇岛066000 河北省海洋动力过程与资源环境重点实验室河北秦皇岛066000 河北省海洋生物与资源重点实验室河北秦皇岛066000 中国水产科学研究院北戴河中心实验站河北秦皇岛066000 河北省海洋与水产科学研究院河北秦皇岛066000

牙鲆是我国黄渤海重要的增殖放流鱼类,野生群体和放流群体的鉴别是评估牙鲆增殖效果的前提。为了研究稳定同位素技术在增殖放流牙鲆群体鉴别中的应用,本研究以秦皇岛近海增殖放流区捕捞牙鲆幼鱼为对象,先使用项目组前期开发的形态学和... 详细信息

牙鲆是我国黄渤海重要的增殖放流鱼类,野生群体和放流群体的鉴别是评估牙鲆增殖效果的前提。为了研究稳定同位素技术在增殖放流牙鲆群体鉴别中的应用,本研究以秦皇岛近海增殖放流区捕捞牙鲆幼鱼为对象,先使用项目组前期开发的形态学和分子标记相结合的方法区分野生群体和放流群体,再分别测定肌肉碳、氮稳定同位素值和耳石(全耳石和耳石核心区域)碳、氧稳定同位素值,并以养殖群体为对照。结果表明:利用肌肉δ^(13)C值(野生群体:-17.19‰±0.73‰;放流群体:-17.10‰±0.61‰;养殖群体:-20.75‰±0.07‰)和δ^(15)N值(野生群体:11.81‰±0.38‰;放流群体:11.62‰±0.48‰;养殖群体:8.64‰±0.60‰)及全耳石中δ^(13)C值(野生群体:-4.47‰±0.35‰;放流群体:-4.63‰±0.29‰;养殖群体:-6.59‰±0.58‰)可鉴别出养殖群体,但是无法区分野生群体和放流群体;利用耳石核心区δ^(13)C值(野生群体:-4.66‰±0.30‰;放流群体:-5.41‰±0.21‰;养殖群体:-5.37‰±0.19‰)可鉴别出野生群体。3个群体全耳石和耳石核心区δ^(18)O值均有重叠,无法对群体进行鉴别。表明利用耳石核心区δ^(13)C值可鉴别重建牙鲆幼鱼群体中的野生群体和放流群体,并在生殖洄游亲鱼群体的鉴别方面有一定的应用前景,这为后续估计增殖放流对牙鲆早期资源量的补充及深入开展增殖放流效果评估工作提供了基础数据和技术手段。

关键词：稳定同位素牙鲆野生群体放流群体养殖群体耳石鉴别

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牙鲆抗淋巴囊肿系肌肉营养成分的分析

水产科学 2023年第3期42卷 449-456页

作者：王桂兴何忠伟刘玉峰张晓彦赵雅贤任玉芹王玉芬侯吉伦中国水产科学研究院北戴河中心实验站河北秦皇岛066100

为研究牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本雌核发育系的肌肉品质,采用常规方法分析比较7月龄体质量分别为(219.88±33.82)g、(213.53±27.20)g和(237.51±26.04)g的母系、父系和抗淋巴囊肿系牙鲆肌肉的营养成分。试验结果显示:牙鲆抗淋巴囊肿系... 详细信息

为研究牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本雌核发育系的肌肉品质,采用常规方法分析比较7月龄体质量分别为(219.88±33.82)g、(213.53±27.20)g和(237.51±26.04)g的母系、父系和抗淋巴囊肿系牙鲆肌肉的营养成分。试验结果显示:牙鲆抗淋巴囊肿系肌肉鲜样中的水分、蛋白质和灰分含量与亲本系无显著差异(P>0.05),但粗脂肪含量显著低于母系(P0.05);3系均含有18种氨基酸,除色氨酸和酪氨酸含量差异显著(P0.05)。根据氨基酸评分和化学评分,3系的第一限制性氨基酸均为色氨酸,必需氨基酸指数分别为抗淋巴囊肿系(87.40)>母系(79.86)>父系(79.04),必需氨基酸组成符合联合国粮食及农业组织/世界卫生组织标准;抗淋巴囊肿系的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量显著低于亲本系,而母系的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的含量丰富,显著高于抗淋巴囊肿品系和父系(P牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本系的营养价值较高,其中抗淋巴囊肿系氨基酸含量最高,而母系的多不饱和脂肪酸中二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸含量最丰富,可作为高脂肪酸选育的候选材料。本试验结果可为牙鲆抗淋巴囊肿新品种选育提供基础数据。

关键词：牙鲆抗淋巴囊肿系营养成分氨基酸脂肪酸

牙鲆感染迟钝爱德华氏菌的miRNA转录组分析

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天津师范大学学报（自然科学版） 2022年第2期42卷 37-45页

作者：山亚男郑津辉高虹天津师范大学生命科学学院天津300387 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室天津300387

为了探究牙鲆感染迟钝爱德华氏菌过程中miRNA的分子调控机制,以牙鲆头肾组织为研究材料,分析其感染迟钝爱德华氏菌后miRNA的差异表达情况.利用高通量测序平台(Illumina HiSeq)分别对感染迟钝爱德华氏菌3 h、6 h以及未感染的牙鲆头肾组织... 详细信息

为了探究牙鲆感染迟钝爱德华氏菌过程中miRNA的分子调控机制,以牙鲆头肾组织为研究材料,分析其感染迟钝爱德华氏菌后miRNA的差异表达情况.利用高通量测序平台(Illumina HiSeq)分别对感染迟钝爱德华氏菌3 h、6 h以及未感染的牙鲆头肾组织的RNA进行转录组测序,并对数据进行生物信息学分析.将测序结果与斑马鱼miRBase数据库进行比对,共鉴定出牙鲆成熟miRNA 537个.将感染组与对照组数据进行比对,得到12个感染组(3 h)差异显著表达的miRNA(2个显著上调,10个显著下调);32个感染组(6 h)差异显著表达的miRNA(20个显著上调,12个显著下调).对感染组差异显著表达的miRNA的靶基因进行GO seq分析,结果显示,感染组(3 h)的富集通路有2793条(P牙鲆感染迟钝爱德华氏菌过程中,差异表达miRNA的靶基因参与的信号通路大部分跟生物过程以及细胞组分中的膜成分有关,生物过程中候选靶基因富集程度最高的GO条目是生物调节,富集程度较高的通路大多跟免疫调节以及分裂分化等生物学过程有关.

关键词：迟钝爱德华氏菌牙鲆 miRNA 转录组高通量差异表达miRNA

一种利用Tol2转座子快速获得牙鲆稳转细胞的方法

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渔业科学进展 2023年

作者：俞海洋杜昕昕常彦红王旭波济宁学院生命科学与生物工程学院宁波大学海洋学院

脂质体转染是分子生物学中研究基因功能和基因表达调控的常规手段。然而，在海水硬骨鱼细胞中，脂质体转染效率低下且很难通过转染后直接筛选的方式获得稳转细胞。本研究以pminiTol2为模板，在末端反向重复序列中间添加了CMV启动子、EGF... 详细信息

脂质体转染是分子生物学中研究基因功能和基因表达调控的常规手段。然而，在海水硬骨鱼细胞中，脂质体转染效率低下且很难通过转染后直接筛选的方式获得稳转细胞。本研究以pminiTol2为模板，在末端反向重复序列中间添加了CMV启动子、EGFP荧光蛋白、新霉素抗性基因等功能区域，构建了CMV-EGFP-pminiTol2重组载体。CMV-EGFP-pminiTol2和pCS-TP质粒经脂质体包裹共转染至牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵巢颗粒细胞后，仅需2～3周的新霉素(G418)筛选即可获得稳定转染的细胞。本实验首次探究了利用Tol2转座子系统快速筛选获得牙鲆稳转细胞的方法，其研究成果可应用于牙鲆分子生物学研究，并为其他硬骨鱼类稳转细胞构建及筛选提供新的思路。

关键词：牙鲆 Tol2转座子稳转细胞脂质体转染

牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染相关的3个基因鉴定及功能验证

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牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染相关的3个基因鉴定及功能验证

作者：张子威南京农业大学

学位级别：硕士

牙鲆作为一种近海冷温底栖鲆鲽鱼类,营养价值高、生长速度快、适合工厂化养殖模式、经济效益高,是我国北方海水鱼类养殖业的重要经济品种。但随着养殖规模扩大,长期的高密度养殖造成牙鲆种质退化,成活率变低,生长速度变慢,抗病能力降低... 详细信息

牙鲆作为一种近海冷温底栖鲆鲽鱼类,营养价值高、生长速度快、适合工厂化养殖模式、经济效益高,是我国北方海水鱼类养殖业的重要经济品种。但随着养殖规模扩大,长期的高密度养殖造成牙鲆种质退化,成活率变低,生长速度变慢,抗病能力降低,养殖过程中病害频发。其中迟缓爱德华氏菌感染造成的腹水病是牙鲆养殖过程中的高发细菌病,严重阻碍我国牙鲆养殖产业发展。研究牙鲆抗细菌病相关基因,发掘分子标记用于辅助育种,构建高抗病力的优良牙鲆家系是解决牙鲆病害问题的有效方法之一。本论文以牙鲆为研究对象,在实验室前期GWAS筛选得到牙鲆抗迟缓爱德华氏菌相关基因的基础上,对免疫相关基因进行克隆鉴定和免疫功能研究,并对牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染家系和易感家系肝micro RNA进行测序分析,筛选影响牙鲆家系抗病力的相关micro RNA及基因,为解析牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染机制提供理论基础。1.牙鲆rnd1基因克隆、表达模式及与抗病力的关系为探索牙鲆rnd1基因在牙鲆免疫应答反应中的作用,分析该基因与牙鲆抗病力的关系,本实验对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关SNP位点的定位,结果显示,Pornd1 c DNA开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸,确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关SNP,该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T。利用实时荧光定量PCR对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测,结果显示,Pornd1在心、肝、肾中的相对表达量较高;迟缓爱德华氏菌感染后肝、肾、脾中Pornd1的表达量在6 h降低后逐渐升高,在48 h达到最高。Pornd1在抗病家系肝脏中的表达量显著高于易感家系。本实验在蛋白水平,利用大肠杆菌表达系统表达Po Rnd1重组蛋白,检测其抑菌活性。结果显示,Po Rnd1重组蛋白对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌和哈维氏弧菌均具有一定抑菌活性,揭示了Pornd1在牙鲆免疫抗病方面的作用,为系统解析牙鲆抗病性状遗传机制提供基础资料。2.牙鲆sh2b3、epg5基因克隆及其在免疫应答中表达模式初步分析为分析牙鲆sh2b3、epg5基因在牙鲆免疫反应中的功能,分析其与牙鲆家系抗病力的关系,实验对Posh2b3、Poepg5基因进行功能鉴定和抗病相关SNP位点定位,Posh2b3基因编码氨基酸含有PH结构域和SH2结构域,在第1内含子上存在抗迟缓爱德华氏菌病相关SNP,该位点在易感家系和抗病家系中分别是G/A;Poepg5基因在第42内含子上存在抗迟缓爱德华氏菌病相关SNP,位点信息为C/T;q RT-PCR对基因的组织分布、抗病家系与易感家系肝中表达差异、感染迟缓爱德华氏菌后表达模式进行检测,结果显示Posh2b3在血、心、肝、脾、肾中表达较高,在抗病家系肝中的表达量显著高于易感家系,在迟缓爱德华氏菌感染后的脾、肾中的表达量变化出现上升趋势;Poepg5在血、心、肝、肾中高表达,在抗病家系肝中的表达量较高,在感染后的脾、肾中表达出现上升趋势。因此认为Posh2b3、Poepg5基因参与了牙鲆抵御细菌侵袭的免疫应答过程,为探究sh2b3、epg5在牙鲆免疫应答过程中的作用机制提供理论基础。3.牙鲆抗迟缓爱德华氏菌家系和易感家系肝脏micro RNA测序分析为探究影响牙鲆家系抗迟缓爱德华氏菌感染能力的因素,对实验室前期构建的抗迟缓爱德华氏菌感染的家系与易感家系肝中micro RNA进行测序分析,筛选得到的差异mi RNA表达上调的共有462个,下调的共有491个;对mi RNA靶基因进行表达差异分析,得到差异mi RNA靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,得到多个相关GO term和免疫相关通路,为后续特征差异mi RNA和差异靶基因的分析提供了研究方向,为揭示牙鲆家系抗病力影响因素奠定了理论基础。

关键词：牙鲆迟缓爱德华氏菌 rnd1 sh2b3 epg5 microRNA