牙鲆（Paralichthys olivaceus）钙网蛋白和血清淀粉样蛋白P成分的抗菌功能研究

作     者：孙佳琪 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李学鹏;徐荣静

授予年度：2024年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：牙鲆 钙网蛋白-1/2 血清淀粉样蛋白P成分 抗菌功能 先天免疫 

摘      要：牙鲆(Paralichthys olivaceus),作为中国海水养殖业的关键经济品种之一,但是在养殖过程中频繁遭受病害问题的困扰,这给养殖业带来了巨大的经济损失。当前,滥用抗生素等水产药物的现象日趋严重,这不仅威胁到水产品的食品安全,更损害了其市场声誉。为了解决这些困扰,本研究从牙鲆先天免疫系统的角度出发,探索切实可行的解决方案。凝集素所介导的蛋白质与碳水化合物之间的相互作用,对于脊椎动物和无脊椎动物的先天免疫至关重要。这种相互作用不仅有助于识别潜在的病原体,还进一步参与到下游的效应功能中,包括凝集、固定、补体介导的调理和杀伤作用。通过这些机制,凝集素在维护生物体的健康与稳定中发挥着不可或缺的作用。钙网蛋白(Calreticulin,Crt)和血清淀粉样蛋白P成分(Serum amyloid P component,SAP)是两种不同类型的凝集素。其中,Crt是一种保守的凝集素样多效蛋白,而SAP则是正五聚蛋白家族的一员,在哺乳动物的免疫反应中,这两种成分都发挥着至关重要的作用。因此,本文中主要研究牙鲆中Crt和SAP两种蛋白抗菌防御功能,研究内容如下: 在牙鲆中存在两种Crts,即PoCrt-1和PoCrt-2。PoCrt-1和PoCrt-2分别由419和427个氨基酸残基组成,总序列相同度为69.09%。PoCrt-1和PoCrt-2都含有一个信号肽和三个功能域,即N、P和C结构域。PoCrt-1和PoCrt-2均在不同组织中呈组成型表达,在肝脏中表达水平最高,并显著地受迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,***)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,***)调控。此外,重组PoCrt-1和PoCrt-2(r PoCrt-1和r PoCrt-2)可与不同的革兰氏阴性菌结合,其中与***的结合指数最高。同时,体外实验表明r PoCrt-1和r PoCrt-2能凝集***、***和鳗弧菌(Vibrio anguillarum,***,抑制细菌生长。同样,体内r PoCrt-1和r PoCrt-2也能显著抑制***的增殖。以上结果为牙鲆中Crt的抗菌免疫作用提供了新的视角。 牙鲆SAP(Po SAP)含有215个氨基酸。Po SAP与其他鱼类SAP序列相似性为55.6～76.1%。系统进化树分析显示,Po SAP与大菱鲆(Scophthalmus maximus)的SAP在进化上的关系最为接近。Po SAP的m RNA在多种组织中广泛的表达,而且在脾脏中的表达量尤为显著;当受到细菌刺激后,Po SAP在不同组织中的表达模式则展现出差异性。重组Po SAP(r Po SAP)能够结合8种不同的细菌。在体外环境中,r Po SAP展现出对多种细菌的抑制生长能力,另外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens,***)具有显著的凝集作用,可直接杀死***。r Po SAP能够促进血清溶血和杀菌,并且能与牙鲆的补体因子C1q-A链和C1q-C链相互作用。细胞实验表明,r Po SAP能与外周血白细胞(PBLs)结合,并可提高PBLs的吞噬活性、趋化活性、细胞增殖能力、免疫相关基因表达、呼吸爆发和抗细菌感染能力。此外,r Po SAP不仅具备诱导中性粒细胞释放胞外陷阱(NETs)的能力,而且在鱼体内,它显著增强了宿主对入侵细菌的清除能力。综上所述,r Po SAP能够单独、以及提高血清、白细胞的活性而发挥抗菌作用。 总而言之,本实验创新性的发现牙鲆PoCrt-1/PoCrt-2和Po SAP无论在体外还是体内都具有显著的免疫抗菌功能,这将填补牙鲆Crts和SAP免疫抗菌功能的理论空白,加深鱼类凝集素相关蛋白的认识,从而为鱼类病害的绿色高效防控提供坚实的理论基础。