检索结果-南通市图书馆

作者：孙佳琪烟台大学

学位级别：硕士

牙鲆(paralichthys olivaceus),作为中国海水养殖业的关键经济品种之一,但是在养殖过程中频繁遭受病害问题的困扰,这给养殖业带来了巨大的经济损失。当前,滥用抗生素等水产药物的现象日趋严重,这不仅威胁到水产品的食品安全,更损害了其... 详细信息

牙鲆(paralichthys olivaceus),作为中国海水养殖业的关键经济品种之一,但是在养殖过程中频繁遭受病害问题的困扰,这给养殖业带来了巨大的经济损失。当前,滥用抗生素等水产药物的现象日趋严重,这不仅威胁到水产品的食品安全,更损害了其市场声誉。为了解决这些困扰,本研究从牙鲆先天免疫系统的角度出发,探索切实可行的解决方案。凝集素所介导的蛋白质与碳水化合物之间的相互作用,对于脊椎动物和无脊椎动物的先天免疫至关重要。这种相互作用不仅有助于识别潜在的病原体,还进一步参与到下游的效应功能中,包括凝集、固定、补体介导的调理和杀伤作用。通过这些机制,凝集素在维护生物体的健康与稳定中发挥着不可或缺的作用。钙网蛋白(Calreticulin,Crt)和血清淀粉样蛋白p成分(Serum amyloid p component,SAp)是两种不同类型的凝集素。其中,Crt是一种保守的凝集素样多效蛋白,而SAp则是正五聚蛋白家族的一员,在哺乳动物的免疫反应中,这两种成分都发挥着至关重要的作用。因此,本文中主要研究牙鲆中Crt和SAp两种蛋白抗菌防御功能,研究内容如下:在牙鲆中存在两种Crts,即poCrt-1和poCrt-2。poCrt-1和poCrt-2分别由419和427个氨基酸残基组成,总序列相同度为69.09%。poCrt-1和poCrt-2都含有一个信号肽和三个功能域,即N、p和C结构域。poCrt-1和poCrt-2均在不同组织中呈组成型表达,在肝脏中表达水平最高,并显著地受迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,***)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,***)调控。此外,重组poCrt-1和poCrt-2(r poCrt-1和r poCrt-2)可与不同的革兰氏阴性菌结合,其中与***的结合指数最高。同时,体外实验表明r poCrt-1和r poCrt-2能凝集***、***和鳗弧菌(Vibrio anguillarum,***,抑制细菌生长。同样,体内r poCrt-1和r poCrt-2也能显著抑制***的增殖。以上结果为牙鲆中Crt的抗菌免疫作用提供了新的视角。牙鲆SAp(po SAp)含有215个氨基酸。po SAp与其他鱼类SAp序列相似性为55.6～76.1%。系统进化树分析显示,po SAp与大菱鲆(Scophthalmus maximus)的SAp在进化上的关系最为接近。po SAp的m RNA在多种组织中广泛的表达,而且在脾脏中的表达量尤为显著;当受到细菌刺激后,po SAp在不同组织中的表达模式则展现出差异性。重组po SAp(r po SAp)能够结合8种不同的细菌。在体外环境中,r po SAp展现出对多种细菌的抑制生长能力,另外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)和荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens,***)具有显著的凝集作用,可直接杀死***。r po SAp能够促进血清溶血和杀菌,并且能与牙鲆的补体因子C1q-A链和C1q-C链相互作用。细胞实验表明,r po SAp能与外周血白细胞(pBLs)结合,并可提高pBLs的吞噬活性、趋化活性、细胞增殖能力、免疫相关基因表达、呼吸爆发和抗细菌感染能力。此外,r po SAp不仅具备诱导中性粒细胞释放胞外陷阱(NETs)的能力,而且在鱼体内,它显著增强了宿主对入侵细菌的清除能力。综上所述,r po SAp能够单独、以及提高血清、白细胞的活性而发挥抗菌作用。总而言之,本实验创新性的发现牙鲆poCrt-1/poCrt-2和po SAp无论在体外还是体内都具有显著的免疫抗菌功能,这将填补牙鲆Crts和SAp免疫抗菌功能的理论空白,加深鱼类凝集素相关蛋白的认识,从而为鱼类病害的绿色高效防控提供坚实的理论基础。

关键词：牙鲆钙网蛋白-1/2 血清淀粉样蛋白p成分抗菌功能先天免疫

青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白p成分基因的克隆、表达与进化分析

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青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白P成分基因的克隆、表达与进化分析

作者：王玉璎鲁东大学

学位级别：硕士

血清淀粉样蛋白p成分(Serum amyloid p component,SAp)是一种短正五聚蛋白,它普遍存在于脊椎动物和无脊椎动物中,具有多种功能,包括参与免疫调节及淀粉样蛋白沉积等,在临床医学方面也具有重要的应用价值。头索动物文昌鱼(Branchiostoma... 详细信息

血清淀粉样蛋白p成分(Serum amyloid p component,SAp)是一种短正五聚蛋白,它普遍存在于脊椎动物和无脊椎动物中,具有多种功能,包括参与免疫调节及淀粉样蛋白沉积等,在临床医学方面也具有重要的应用价值。头索动物文昌鱼(Branchiostoma)是无脊椎和脊椎动物之间的一类过渡型动物,在过去的200多年里,文昌鱼已经成为研究脊椎动物起源与进化的典型模式动物,在比较免疫学、发育生物学和细胞遗传学等领域的研究中发挥了关键性作用。本论文以青岛文昌鱼(***)为实验对象,进行了SAp基因的分子克隆、原核表达、原位杂交和实时定量探索,并利用生物信息学软件对其进行进化分析,研究结果如下:1、运用RT-pCR和RACE技术,克隆出青岛文昌鱼SAp基因c DNA全长序列,该序列含有1438个碱基,其中5’非编码端有200个碱基,3’非编码端有293个碱基,开放阅读框有945个碱基,编码314个氨基酸,预测该蛋白的理论分子质量是35.6 k Da,其理论等电点为5.92,原子总量为4988,分子式为CHNOS,具有分子间盐桥、Ca结合位点和正五聚蛋白结构域。应用生物信息学软件进行了一系列的分析,结果显示青岛文昌鱼SAp基因的进化地位处于无脊椎和脊椎动物之间,并与无脊椎动物的亲缘关系较近。2、利用DNA重组技术,成功构建了p ET28a(+)-SAp的重组质粒,经IpTG诱导后表达的蛋白,通过SDS-pAGE电泳和WB实验验证是SAp目的蛋白。这为后续研究青岛文昌鱼SAp蛋白是否可以体外表达及SAp蛋白纯化和结构及功能分析奠定了基础。3、采用原位杂交技术研究了SAp基因在青岛文昌鱼体内的组织表达情况。实验结果显示,SAp基因在青岛文昌鱼成体的腹褶内淋巴窦、卵巢、肌膜、鳃上沟和肝盲囊中表达,并且在不同的组织中的表达量有明显差异,其中腹褶内淋巴窦中的表达量最高,卵巢、肌膜、鳃上沟和肝盲囊的表达量相对较少,基于SAp基因在某些免疫器官或组织表达,推测SAp可能参与了青岛文昌鱼的免疫反应。4、利用q pCR技术分析了青岛文昌鱼SAp基因在不同的刺激物中的表达量的变化。在Cu浓度为0.01 mg/L时,SAp基因表达量达到峰值,随着Cu浓度的逐渐增加,SAp基因的表达量逐步降低。在副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和LpS的胁迫下,均是在第6 h时,SAp基因表达量达到峰值,随后表达量逐渐下降。结果显示,在不同刺激物的胁迫下SAp基因的表达量也有一定的差异,并且随不同刺激物胁迫时间的延长,SAp基因的表达量呈现的表达趋势具有一致性,确定SAp参与了青岛文昌鱼体内的免疫反应,初步推测SAp在青岛文昌鱼抗毒害和先天性免疫过程中具有一定的防御作用,并且提示SAp可作为青岛文昌鱼感染早期的一种生物标志物。

关键词：青岛文昌鱼血清淀粉样蛋白p成分克隆表达进化分析

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）非特异性免疫相关基因SAp和pTX1的克隆、表达和功能研究

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半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）非特异性免疫相关基因SAP和P...

作者：王婷中国科学院研究生院(海洋研究所)

学位级别：硕士

非特异性免疫是机体抵抗外源病原菌入侵的第一道防线,同时在清除病原菌、修复损伤组织、激活和调节特异性免疫应答反应等方面发挥着重要作用。非特异性免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成,体液免疫系统中最重要的组成成分是能识别病原体... 详细信息

非特异性免疫是机体抵抗外源病原菌入侵的第一道防线,同时在清除病原菌、修复损伤组织、激活和调节特异性免疫应答反应等方面发挥着重要作用。非特异性免疫系统由细胞免疫和体液免疫组成,体液免疫系统中最重要的组成成分是能识别病原体相关分子模式的体液模式识别分子。在哺乳动物中,血清淀粉样p成分(serum amyloid p component,SAp)和正五聚蛋白-1(pentraxin-1,pTX1)作为经典的体液模式识别分子,拥有进化上保守的功能,如激活和调控补体级联反应,发挥凝集、中和和调理作用,调节炎症反应等。然而,目前有关鱼类SAp和pTX1的功能研究十分有限,特别是免疫功能研究。在本论文中,我们克隆了半滑舌鳎SAp(CsSAp)和pTX1(CspTX1)基因,分析了它们在mRNA水平上的表达变化情况,并检测了CsSAp和CspTX1重组蛋白(rCsSAp和rCspTX1)的抗细菌和抗病毒免疫作用。CsSAp的开放性阅读框有672个碱基,共编码224个氨基酸。CsSAp与已知鱼类的SAp样蛋白有46%-58%的序列相似性,且在细菌和病毒感染的情况下表达量显著上调。功能研究结果表明,rCsSAp能结合多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,且这种结合活性有蛋白浓度依赖性和菌种特异性。体外实验发现rCsSAp结合细菌后,能显著增强宿主吞噬细胞的吞噬活性。体内组织侵染实验发现,rCsSAp能有效帮助宿主抵抗细菌和病毒感染。与此相反,特异性抗体封闭宿主体内天然的CsSAp后,半滑舌鳎清除入侵细菌的能力显著降低。这些结果首次证明了鱼类的SAp蛋白在宿主抗细菌和抗病毒免疫反应中发挥着重要作用。CspTX1蛋白包含223个氨基酸,与其它已知鱼类的正五聚蛋白有38.8%-49.3%的序列相似性。正常生理条件下,CspTX1在多个组织中均有表达,且在细菌和病毒感染的情况下表达量显著上调。由于CspTX1包含一个能结合胞外抗原的正五聚蛋白结构域,因此rCspTX1能与多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌相互作用。同时,rCspTX1也能以钙依赖的方式使细菌发生凝集。体外实验发现,rCspTX1对细菌包膜的渗透性有一定的影响,进而抑制荧光假单胞菌的生长和增殖。体内组织侵染实验发现,rCspTX1能有效帮助宿主抵抗细菌感染。上述结果表明,CspTX1作为经典的模式识别分子,能促进半滑舌鳎抗细菌感染,在宿主非特异性免疫反应中发挥着重要作用。

关键词：半滑舌鳎非特异性免疫血清淀粉样蛋白p成分正五聚蛋白-1 细菌凝集作用抗菌作用抗病毒作用

人精子甘露糖受体的纯化及其肽质量指纹谱鉴定

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人精子甘露糖受体的纯化及其肽质量指纹谱鉴定

作者：刘志春福建医科大学

学位级别：硕士

受精机理是生命科学的重要理论课题,其阐明对生殖调控具有重大意义,然而受精的分子机制尤其是精卵融合机制,到目前为止并没有完全阐明,人精子甘露糖受体(Mannose receptor,MR)的提出和发现,为人类受精机制的阐明,提供了可能的途径。由... 详细信息

受精机理是生命科学的重要理论课题,其阐明对生殖调控具有重大意义,然而受精的分子机制尤其是精卵融合机制,到目前为止并没有完全阐明,人精子甘露糖受体(Mannose receptor,MR)的提出和发现,为人类受精机制的阐明,提供了可能的途径。由于以往的研究仅在于人精子MR的分布、生化特性及生理功能几个方面,为了进一步探讨MR的分子本质,本研究采用甘露糖-琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化人精子MR,纯化蛋白采用自行制备的DMA-Biotin探针进行亲和斑点杂交试验及Western blot以鉴定其甘露糖结合活性。然后,纯化蛋白经胰蛋白酶酶切后,获得的肽段被用于MALDI-TOF-MS分析,利用Mascot搜索引擎对肽质量指纹谱进行数据库检索,其中蛋白质数据库选择Swissprot库。最后,对检索得到的蛋白进行免疫印迹鉴定。结果显示:(1)自行制备的DMA-Biotin探针经亲和斑点杂交试验证明是有效的;(2)纯化蛋白经亲和斑点杂交试验证明具有甘露糖结合活性并且有显著的特异性;(3)纯化蛋白在nonreduce条件下(上样缓冲液不含β-巯基乙醇(2-ME))进行SDS-pAGE,结果可见四条大小分别为27kDa、34kDa、72kDa和121kDa的蛋白条带,在reduce条件下(上样缓冲液含2-ME),可见27kDa、34kda、72kDa蛋白条带,但没有121kDa条带、72kDa蛋白条带染色变浅,而27kDa蛋白条带染色加深。蛋白转膜后用DMA-Biotin探针标记,只有27kDa和72kDa蛋白具有甘露糖结合活性;(4)肽质量指纹谱鉴定27kDa、72kDa和121kDa蛋白均为人血清淀粉样蛋白p成分(SAp)前体,提示72kDa蛋白和121kDa蛋白可能是27kDa蛋白的多聚体;(5)采用抗人SAp抗体进行免疫印迹试验,证实27kDa蛋白为SAp;(6)肽质量指纹谱鉴定,34kDa蛋白为膜联蛋白(ANXA5、ANXA1、ANXA2),但抗人ANXA5抗体的免疫印记试验表明,34kDa蛋白不是ANXA5。综上所述,得出以下结论: 本研究利用甘露糖-琼脂糖凝胶亲和层析方法首次从人精子上分离到了SAp,该蛋白具有甘露糖结合活性,很可能是人精子的甘露糖受体。

关键词：人精子甘露糖受体纯化肽质量指纹谱膜联蛋白血清淀粉样蛋白p成分