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大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

华西口腔医学杂志 2004年第1期22卷 19-22页

作者：凌均棨谷海晶高燕王阿丹中山大学光华口腔医院牙体牙髓科广东广州510055

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法 ,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织 ,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态 ,电镜观察体内牙囊组织和体... 详细信息

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法 ,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织 ,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态 ,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果　分离组织培养 2 4h后 ,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出 ,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样 ,电镜下牙囊细胞无桥粒 ,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网 (RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论　运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞。

关键词：大鼠牙囊细胞体外培养技术超微结构免疫组化细胞培养

SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究

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华西口腔医学杂志 2013年第1期32卷 4-7,12页

作者：杨尊刘婷郑鸿邓锋宋锦璘重庆医科大学附属口腔医院正畸科重庆市口腔疾病与生物医学研究中心重庆401147

目的转染猿肾病毒SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊细胞,获取具有无限增殖能力和稳定生物学性状的牙囊细胞用于牙周组织工程的研究。方法利用293细胞包装病毒构建含SV40Tag的逆转录病毒载体,制备重组逆转录病毒并转染至SD大鼠牙囊细胞。以... 详细信息

目的转染猿肾病毒SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊细胞,获取具有无限增殖能力和稳定生物学性状的牙囊细胞用于牙周组织工程的研究。方法利用293细胞包装病毒构建含SV40Tag的逆转录病毒载体,制备重组逆转录病毒并转染至SD大鼠牙囊细胞。以正常牙囊细胞为对照,倒置显微镜下观察细胞形态及活力,分析细胞端粒酶活性,并检测其成骨分化及增殖特性。结果转染SV40Tag基因后,SD大鼠牙囊细胞传代至60代,生长依然旺盛,存在较强活力;牙囊细胞端粒酶活性显著增强,与对照组有统计学差异(P=0.033);牙囊细胞成骨分化相关基因(碱性磷酸酶、骨钙素、骨形态发生蛋白、Runx2基因)、促有丝分裂相关基因(碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子)的电泳条带与对照组均无统计学差异(P>0.05)。结论 SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后具有无限传代增殖和抗衰老的潜在能力,其细胞生物学特性相对稳定,可为牙周组织工程提供较理想的种子细胞来源。

关键词：牙囊细胞基因转染端粒酶成骨分化增殖

牙囊细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原复合材料体外相容性研究

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重庆医学 2009年第17期38卷 2189-2190,2193,F0002页

作者：叶国董伟吴亚菲付钢重庆医科大学附属口腔医院 400015 四川大学华西口腔医院牙周科成都610041

目的探讨大鼠牙囊细胞(DFCs)与纳米晶羟基磷灰石/胶原复合材料(nHAC)的相容性,为二者在牙周组织工程中的应用提供依据。方法将大鼠DFCs与nHAC在体外复合培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法、碱性磷酸酶活... 详细信息

目的探讨大鼠牙囊细胞(DFCs)与纳米晶羟基磷灰石/胶原复合材料(nHAC)的相容性,为二者在牙周组织工程中的应用提供依据。方法将大鼠DFCs与nHAC在体外复合培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法、碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖分化的影响。结果DFCs可以在nHAC材料表面及孔隙中良好的黏附、增殖和分化,复合培养5d后nHAC对DFCs的增殖分化表现出一定的促进作用。结论DFCs与nHAC具有良好的生物相容性。

关键词：牙囊细胞纳米羟基磷灰石/胶原复合材料生物相容性

骨形态发生蛋白9体外诱导牙囊细胞的成骨分化

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中国组织工程研究 2015年第14期19卷 2255-2260页

作者：吴艳黄兰重庆医科大学附属口腔医院正畸科口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室重庆市401147

背景:有研究表明骨形态发生蛋白9能促进多种干细胞的成骨分化,但其是否具有诱导牙囊细胞成骨向分化的能力尚不清楚。目的:探讨骨形态发生蛋白9对大鼠牙囊细胞成骨分化的诱导作用。方法:以纯化的第3代大鼠牙囊细胞为研究对象,感染骨形态... 详细信息

背景:有研究表明骨形态发生蛋白9能促进多种干细胞的成骨分化,但其是否具有诱导牙囊细胞成骨向分化的能力尚不清楚。目的:探讨骨形态发生蛋白9对大鼠牙囊细胞成骨分化的诱导作用。方法:以纯化的第3代大鼠牙囊细胞为研究对象,感染骨形态发生蛋白9腺病毒后,检测牙囊细胞中碱性磷酸酶活性、钙盐沉积以及矿化相关因子基因和蛋白的表达变化。结果与结论:感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞碱性磷酸酶活性持续增强,钙盐沉积明显增强。Real time PCR检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中矿化相关因子碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白和核心结合因子mR NA表达增强。Western blot检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中骨桥蛋白的表达增强。以上结果表明骨形态发生蛋白9可诱导牙囊细胞向成骨方向分化。

关键词：干细胞分化牙齿干细胞牙囊细胞骨形态发生蛋白9 成骨分化国家自然科学基金

裸露角质蛋白同源物2正向调控大鼠牙囊细胞的成骨向分化研究

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中华口腔医学杂志 2017年第7期52卷 432-438页

作者：侯玉峦凌均棨陈婵婵权晶晶杜宇中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科·广东省口腔医学重点实验室广州510055

目的检测裸露角质蛋白同源物2（nakedcuticlehomo／og2，Nkd2）在大鼠牙根形成和牙囊细胞成骨向分化过程中的表达变化，为探讨Nkd2在牙囊细胞成骨向分化中的具体分子机制提供实验基础。方法免疫组化法检测Nkd2在SD大鼠出生后1、3、5、7... 详细信息

目的检测裸露角质蛋白同源物2（nakedcuticlehomo／og2，Nkd2）在大鼠牙根形成和牙囊细胞成骨向分化过程中的表达变化，为探讨Nkd2在牙囊细胞成骨向分化中的具体分子机制提供实验基础。方法免疫组化法检测Nkd2在SD大鼠出生后1、3、5、7、9、11及13d下颌第一磨牙牙胚近基底侧牙囊组织中的表达。茜素红染色和十六烷基吡啶观察分析大鼠牙囊细胞（dentalfolliclecellsofrat，rDVC）矿化诱导l、2、3周钙化结节形成情况。蛋白质印迹法分析rDFC矿化诱导1、2、3周Nkd2蛋白表达变化及其与成骨因子碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、Runt相关转录因子2（***-2，RUNX2）和骨钙蛋白的关系。小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）沉默rDFC中Nkd2（siRNA干扰组，Si组），经矿化诱导1周，蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR（quantitativereal—timePCR，qPCR）检测Si组、阴性对照组（阴性对照RNA组，negativecontrolRNAgroup，Nc组）和空白对照组（mockcontrolgroup，Mock组）Nkd2及其mRNA与ALP、RUNX2和骨钙蛋白的表达变化。结果免疫组化结果显示，大鼠牙根形成中Nkd2在下颌第一磨牙牙胚基底侧牙囊组织中的表达呈现时间差异。随rDFC成骨诱导时间增加，茜素红染色矿化结节逐渐增多，十六烷基吡啶吸光度值逐渐增高（0、1、2、和3周吸光度值分别为0．017±0．005、0．702±0．044、1．812±0．531及2．767±0．253）。蛋白质印迹法结果显示，矿化诱导早期矿化组Nkd2（1．60±0．23）较对照组（1）表达显著上调（P〈0．05），Nkd2表达趋势与成骨相关因子表达趋势一致。siRNA干扰rDFC矿化诱导1周后si组较Nc、Mock组Nkd2和成骨因子在蛋白和mRNA水平显著降低（P〈O．05），Nc与Mock组Nkd2和成骨因子表达差异无统计学意义（P〉0．05）。Si、Nc和Mock组蛋白相对表达量分别为Nkd2：0．42±0．10、1．12±0．07、1；ALP：0．70±0．15、1．11±0．14、1；RUNX2：0．58±0．08、0．93±0．08、1；骨钙蛋白：0．64±0．06、0．99±0．02、1；Si、Nc和Mock组mRNA相对表达量分别为Nkd2：0．39±0．05、0．96±0．10、1；ALP：0．15±0．13、1．01±0．07、1；RUNX2：0．39±0．31、0．97±0．13、1；骨钙蛋白：0．17±0．08、1．08±0．21、1。结论大鼠牙根形成过程中Nkd2参与了牙囊组织的分化，并正向调控大鼠牙囊细胞的早期成骨向分化。

关键词：牙囊裸露角质蛋白同源物2 牙囊细胞成骨向分化

重组pEGFP-N1-IGF-Ⅰ基因表达质粒促进SD大鼠牙囊细胞增殖及早期成骨分化效应的实验研究

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重庆医科大学学报 2017年第1期42卷 92-97页

作者：李亚明田常生胡波曹礼宋锦璘重庆医科大学附属口腔医院口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室重庆401147 重庆医科大学附属第二医院口腔科重庆400010

目的:通过胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合表达,构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-Ⅰ。体外实验分析脂质体介导pEGFP-N1-IGF-Ⅰ转染SD大鼠牙囊细胞(rat dental follicle cells,rDFCs)对其增殖及早期成骨分化效应的影响。方法:体外分离培养rDFCs并分为空白组、pEGFPN1-IGF-Ⅰ组、pEGFP-N1+脂质体组和pEGFP-N1-IGF-Ⅰ+脂质体组。采用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测法检测ALP活性,PCR检测Ⅰ型胶原(collagen type 1,Col1)表达情况。结果:荧光显微镜观察结果表明pEGFP-N1-IGF-Ⅰ成功转染入rDFCs。转染后48 h,脂质体处理组(pEGFP-N1+脂质体组和pEGFP-N1-IGF-Ⅰ+脂质体组)转染效率较非脂质体处理组(空白组和pEGFP-N1-IGF-Ⅰ组)高。MTT结果表明,pEGFP-N1-IGF-Ⅰ能增强rDFCs细胞活性,而脂质体毒性对细胞活性具有抑制作用。ALP活性检测结果显示pEGFP-N1-IGF-Ⅰ能增强rDFCs的ALP活性。PCR结果证明pEGFP-N1-IGF-Ⅰ能增加Col1α1及Col1α2的相对表达量。结论:pEGFP-N1-IGF-I能促进rDFCs增殖和早期成骨分化效应,为IGF-Ⅰ基因在牙周组织修复再生中的应用提供了实验依据。

关键词：胰岛素样生长因子-Ⅰ 牙囊细胞增殖早期成骨分化

牙囊细胞对健康/炎症组织来源牙周膜干细胞增殖、分化及干性的影响

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牙囊细胞对健康/炎症组织来源牙周膜干细胞增殖、分化及干性的影响

作者：刘佳第四军医大学

学位级别：硕士

PDLSCs因具有较强的自我更新和多向分化能力而被广泛应用于牙周组织再生中，为了获得更好的再生效果，尤其是在牙周病微环境下，PDLSCs多向分化潜能会受到不利的影响而发生降低，众多学者纷纷着眼于如何优化PDLSCs的生物学特性。DFCs是... 详细信息

PDLSCs因具有较强的自我更新和多向分化能力而被广泛应用于牙周组织再生中，为了获得更好的再生效果，尤其是在牙周病微环境下，PDLSCs多向分化潜能会受到不利的影响而发生降低，众多学者纷纷着眼于如何优化PDLSCs的生物学特性。DFCs是牙周组织中的间充质干细胞，也是一种发育期的前体细胞，以往很多研究主要集中于DFCs的多向分化潜能。鉴于共培养的方式可以模拟体内微环境，促进两种细胞间的相互作用，而DFCs和PDLSCs在牙齿发育过程中具有十分密切的关系，本实验设立DFCs和H/PPDLSCs的共培养体系，假设DFCs能够提供一种良好的微环境，使处于其中的H/PPDLSCs的生物学特性得到优化，以期获得更好的牙周再生效果。实验分为三部分： 1. DFCs、H/PPDLSCs的培养、鉴定及共培养系统的建立目的：获得实验所需的三种细胞，并分别建立DFCs和HPDLSCs、PPDLSCs的共培养体系。方法：分别从健康牙周组织和牙周病患者的牙周组织获得HPDLSCs和PPDLSCs，从青少年处于牙胚状态的智齿获得DFCs，对三种细胞进行原代培养，纯化后采用流式细胞术进行间充质干细胞表面标记物的鉴定，并利用克隆形成实验和成骨成脂实验对HPDLSCs和PPDLSCs进行增殖和多向分化能力的鉴定;最后利用transwell小室建立DFCs和HPDLSCs、PPDLSCs的共培养系统。结果：健康以及患牙周病的牙周组织均可以获得PDLSCs，青少年牙囊组织可以获得DFCs。这三种细胞CD146、CD105、CD90、CD29均呈强阳性表达，而CD45呈阴性表达，说明本实验获得的HPDLSCs、PPDLSCs及DFCs为间充质来源的干细胞;增殖分化实验提示PPDLSCs较HPDLSCs克隆形成能力强，而成骨成脂能力弱，提示牙周病的不利微环境影响了PDLSCs的功能;共培养系统中DFCs和PDLSCs生长良好，共培养系统得以成功建立，为后续实验奠定了基础。 2. DFCs对H/PPDLSCs自我更新能力的影响目的：探索DFCs对HPDLSCs、PPDLSCs的自我更新能力（包括干性和增殖能力）的影响。方法：在共培养系统建立后，利用Real Time RT-PCR检测下层PDLSCs干性相关基因Sox2、Oct4、Klf4的表达;利用克隆形成实验和细胞周期实验检测与DFCs共培养后HPDLSCs、PPDLSCs的克隆形成率的变化和细胞周期中处于G2+S期的细胞百分比的改变。结果：在与DFCs共培养后，HPDLSCs、PPDLSCs中Sox2、Oct4、Klf4的基因水平均发生明显上调;克隆形成率也得到了很大程度的增加;而细胞周期结果显示HPDLSCs和PPDLSCs中处于G2+S期的细胞百分比显著增多;其中PPDLSCs各项指标上调幅度明显高于HPDLSCs。结论：与DFCs共培养不同程度的增加了HPDLSCs、PPDLSCs的自我更新能力。 3. DFCs对H/PPDLSCs多向分化能力的影响目的：评估与DFCs共培养之后对HPDLSCs、PPDLSCs的多向分化能力（包括成骨、成脂能力）的影响。方法：在建立与DFCs的共培养系统后分别对其进行成骨成脂诱导实验，诱导后进行ALP染色和ALP活性检测观察共培养后HPDLSCs、PPDLSCs的ALP活性的改变;利用Real Time RT-PCR检测成骨基因Runx2、OCN、ALP的表达和成脂基因PPARγ的表达;采用Western Blot检测Runx2蛋白水平的变化;对共培养后HPDLSCs、PPDLSCs分别进行茜素红染色和油红O染色以观察矿化结节和脂滴的形成情况。结果：在与DFCs共培养后HPDLSCs、PPDLSCs的ALP活性均得到明显增强;Runx2、OCN、ALP、PPARγ基因水平也发生了大幅上调，Runx2蛋白变化趋势与基因结果一致;茜素红和油红O染色结果显示DFCs增加了HPDLSCs、PPDLSCs形成矿化结节和脂滴的数量;PPDLSCs的成骨成脂能力上调幅度显著高于HPDLSCs。结论：DFCs从不同程度优化了HPDLSCs、PPDLSCs的成骨成脂分化能力。综上所述，DFCs作为一种牙周组织来源的间充质干细胞和发育期的前体细胞，可以提供一种良好的微环境并发挥其优化调节作用，优化HPDLSCs的自我更新和多向分化潜能，恢复PPDLSCs因炎症而下降的生物学功能，为利用H/PPDLSCs进行的牙周再生奠定良好的基础。

关键词：牙囊细胞牙周膜干细胞共培养微环境

PKC、PKA信号通路在调控体外培养人牙囊细胞VEGF表达中的作用

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中国细胞生物学学报 2012年第5期34卷 447-453页

作者：陈学鹏段银钟钱红金作林浙江大学医学院附属口腔医院正畸科杭州310006 第四军医大学口腔医学院正畸科西安710032

该文主要探讨PKC、PKA信号通路在调控体外培养人牙囊细胞VEGF表达中的作用。选取生长状态良好的第4代人牙囊细胞,采用Real-time PCR和Western blot分别检测PKC激动剂(PMA)、PKC非特异性抑制剂(G 6983)、PKC-α和γ特异性抑制剂(HBDDE)、... 详细信息

该文主要探讨PKC、PKA信号通路在调控体外培养人牙囊细胞VEGF表达中的作用。选取生长状态良好的第4代人牙囊细胞,采用Real-time PCR和Western blot分别检测PKC激动剂(PMA)、PKC非特异性抑制剂(G 6983)、PKC-α和γ特异性抑制剂(HBDDE)、PKC-β特异性抑制剂(LY333531)、PKA激动剂(dbcAMP)和抑制剂(KT5720)对体外培养人牙囊细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响。结果显示,PMA组和PMA+HBDDE组VEGF mRNA和蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。dbcAMP组VEGF mRNA和蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。这表明,PKC、PKA信号通路均参与了体外培养人牙囊细胞VEGF表达的调控,其中PKC信号通路中参与调控的亚型是PKC-β。

关键词：牙囊细胞血管内皮生长因子蛋白激酶C 蛋白激酶A

p38 MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用

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中国细胞生物学学报 2013年第6期35卷 816-823页

作者：陈学鹏施洁珺叶青松蔡霞张天厚浙江大学医学院附属口腔医院正畸科杭州310006 詹姆斯库克大学牙学院正畸科浙江大学医学院附属口腔医院牙周科杭州310006 浙江大学医学院附属第二医院口腔科杭州310009

该文主要探讨p38 MAPK信号通路在人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用。从人成骨肉瘤细胞株MG-63中克隆hBMP-2基因,通过基因重组技术构建pcDNA3.1(+)-hBMP-2真核表达质粒,采用脂质体法转染人牙囊细胞,以G418筛选... 详细信息

该文主要探讨p38 MAPK信号通路在人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导人牙囊细胞成骨分化中的作用。从人成骨肉瘤细胞株MG-63中克隆hBMP-2基因,通过基因重组技术构建pcDNA3.1(+)-hBMP-2真核表达质粒,采用脂质体法转染人牙囊细胞,以G418筛选得到能够稳定表达BMP-2的细胞克隆。Quantitative Real-time RT-PCR及Western blot检测BMP-2目的基因和蛋白的表达。以p38 MAPK特异性抑制剂SB203580作用于稳定表达BMP-2的人牙囊细胞,观察MAPKAP激酶-2磷酸化蛋白、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达水平变化。结果显示,通过基因重组和基因转染获得能够稳定表达BMP-2的人牙囊细胞。SB203580明显降低MAPKAP激酶-2磷酸化蛋白的表达水平。BMP-2水平持续高表达能诱导人牙囊细胞碱性磷酸酶活性升高,同时增强OSX、Runx2、OCN、BSP及OPN等成骨相关基因的表达水平,但BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化的作用被SB203580抑制。这表明,p38 MAPK信号通路在BMP-2诱导人牙囊细胞成骨分化中发挥调控作用。

关键词：牙囊细胞骨形态发生蛋白-2 成骨分化 p38 MAPK信号通路