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烟曲霉酸合成基因簇中后修饰基因的分析和应用研究

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烟曲霉酸合成基因簇中后修饰基因的分析和应用研究

作者：陈苗苗华东理工大学

学位级别：硕士

甾体药物生产过程中,微生物转化反应占有不可取代的地位,其中重要的反应有羟基化反应和C1,2位脱氢反应。产烟曲霉酸等甾型抗生素的真菌,例如烟曲霉和金龟子绿僵菌等,具有优良的甾体羟化和C1,2位脱氢能力。鉴于甾型抗生素与甾体药物在结... 详细信息

甾体药物生产过程中,微生物转化反应占有不可取代的地位,其中重要的反应有羟基化反应和C1,2位脱氢反应。产烟曲霉酸等甾型抗生素的真菌,例如烟曲霉和金龟子绿僵菌等,具有优良的甾体羟化和C1,2位脱氢能力。鉴于甾型抗生素与甾体药物在结构上具有相似性且在其甾核上具有C1,2位不饱和双键和多个羟基基团,因此在基因水平上分析烟曲霉酸等甾型抗生素的合成机理,有利于了解这些真菌在甾体药物转化方面的作用。本研究的目的是研究烟曲霉酸合成基因簇中后修饰基因的功能及其在甾体药物制备中的价值。 1.金龟子绿僵菌中烟曲霉酸合成基因簇的克隆和基因功能分析金龟子绿僵菌是甾体药物羟化反应的常用菌,具有较高的烟曲霉酸生产水平。为了获得该菌的烟曲霉酸合成基因簇,我们构建了fosmid文库,根据已知烟曲霉基因组信息和金龟子绿僵菌EST标签库,利用了4对兼并引物,对fosmid文库进行了筛选,得到了3株阳性克隆子,经基因测序拼接,我们揭示了该菌23kb长的烟曲霉酸基因簇序列信息,并对其所含有的基因进行了分析。该基因簇包含1个甾核环化酶,1个3-甾酮-Δ1-脱氢酶,1个短链脱氢酶,2个乙酰转移酶,4个P450酶。该基因簇的基因构成与烟曲霉中烟曲霉酸基因簇类似。 2.烟曲霉酸基因簇中P450基因的功能分析烟曲霉酸基因簇中4个P450酶的具体催化功能尚未得到鉴定,为了确定P450酶在烟曲霉酸合成过程中的具体功能,我们对其中一个P450基因进行了分析。通过农杆菌介导的真菌操作工具在烟曲霉中敲除了该P450基因,同步分析野生菌和敲除菌的发酵产物,HPLC检测结果显示,与野生型相比,敲除株不产烟曲霉酸也不产生可检测的其它烟曲霉酸衍生物,这表明该P450基因在烟曲霉酸的合成过程中起重要作用。 3.烟曲霉酸基因簇中3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因在甾体药物转化方面的功能鉴定和酶学性质分析烟曲霉酸基因簇中的3-甾酮-△1-脱氢酶（ksdDF）基因被认为是催化烟曲霉酶酸C1,2位双键形成的基因,但其在3-甾酮-Δ4-烯类甾体药物的转化方面是否具有C1,2位脱氢功能,则尚未得到确认。烟曲霉中烟曲霉酸基因簇的ksdD基因（GeneID:3508866）编码596aa,分子量64.1795kD。对其氨基酸序列的分析发现,其与细菌来源的内在膜蛋白KsdD不同,该真菌源KsdDF是一个可溶性蛋白、无明显膜嵌入序列。将该基因在大肠杆菌E coli（λDE3）中进行表达并对其KsdD酶活进行定位,发现KsdD活性几乎全部存在于细胞上清中,表明该酶以可溶性的形式表现活性,而不是膜结合蛋白。以雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）为底物,该酶的Km值为2×10-4mol/l。将该基因在毕赤酵母GS115中进行表达并对KsdD酶活进行定位,同样发现KsdDF活性几乎全部存在于细胞上清中,印证了KsdDF是可溶性蛋白。虽然以pPIC3.5k载体对KsdDF进行胞内表达时,发现该酶表现很好的活性,但以pPIC9k载体对KsdDF进行胞外分泌表达时,该酶却不表现任何活性。KsdD通常被认为是膜界面蛋白,这一结果暗示在烟曲霉中KsdDF可能为外在膜蛋白或者其正确构型的形成需要膜起辅助作用。以AD为底物,毕赤酵母表达的KsdDF酶学动力学参数是：Km值为5×10-5mol/l,Vm值为51.68U/mg。 4. KsdDF毕赤酵母工程菌的构建细菌来源的KsdD均有两段膜嵌入序列,为内在膜蛋白,异源表达多为包涵体,很难构建成功高活性异源表达基因工程菌。而KsdDF能在大肠杆菌和毕赤酵母中以可溶性高活性形式表达,表明其适合进行异源表达基因工程菌的构建。将ksdDF基因连接载体pPIC3.5K导入毕赤酵母KM71和GS115中,在摇瓶发酵水平上,重组KM71可以100%的转化率,将1.0g/l AD转化为雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）;重组GS115可以100%的转化率,将1.5g/lAD转化为ADD和宝丹酮（BD）,ADD和BD之间由酵母体内的17-羟基甾体脱氢酶可逆催化,由还原力决定,通过在发酵后期添加3%的葡萄糖可实现发酵产物中BD占ADD/BD混合物的80%（摩尔浓度）以上。以上毕赤酵母KM71和GS115重组菌显示了良好的ADD和BD生产能力,后续工作可对其进行过程工程放大研究。综上所述,本论文找到了金龟子绿僵菌合成烟曲霉酸基因簇,与烟曲霉基因簇相比较,虽然基因的相似性较低,但烟曲霉酸合成路径和基因组织形式相似。通过对基因簇中一个P450基因的研究,我们确定了该基因在烟曲霉酸合成中的重要作用,并为基因簇其他基因的鉴定奠定了方法学基础。通过对烟曲霉ksdDF的研究,我们发现了一种可溶性KsdD,并构建成功可高效转化AD积累ADD和BD的基因工程菌

关键词：金龟子绿僵菌烟曲霉烟曲霉酸 3-甾酮-△~1-脱氢酶雄甾-4-烯-3,17-二酮雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

烟曲霉菌Aspergillus fumigatus发酵生产烟曲霉酸的研究

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烟曲霉菌Aspergillus fumigatus发酵生产烟曲霉酸的研究

作者：徐帆华东理工大学

学位级别：硕士

烟曲霉酸(havolicacid)是一种典型的四环三萜类化合物,其具有良好的抗菌活性和显著的抗癌效果。然而,烟曲霉酸目前的发酵水平极低,严重制约了其进一步临床研究及药用推广。本文所采用的烟曲霉酸生产菌株烟曲霉Aspergillus fumigatus是... 详细信息

烟曲霉酸(havolicacid)是一种典型的四环三萜类化合物,其具有良好的抗菌活性和显著的抗癌效果。然而,烟曲霉酸目前的发酵水平极低,严重制约了其进一步临床研究及药用推广。本文所采用的烟曲霉酸生产菌株烟曲霉Aspergillus fumigatus是一株海蟹共生菌,由南京大学谭仁祥课题组提供。通过单因素方法优化了种子的接种量、种子的培养时间、氮源、碳源、发酵周期和初始pH等条件。研究发现烟曲霉酸的代谢较容易受到烟曲霉菌初级代谢的影响,因此在之后的研究中考察了发酵过程中生物量的积累。在确定了发酵条件之后,采用数理统计方法优化了发酵培养基。首先,通过Plackett-Burman实验设计找出了对烟曲霉酸产量有显著性影响的因素:甘露醇、硝酸钠、牛肉膏。之后,通过爬坡实验确定了这三个因素的中心水平。在此基础上,通过响应面实验开展了进一步的优化,在摇瓶水平提高了烟曲霉酸的产量。最佳发酵培养基如下:甘露醇39.88 g/L、硝酸钠2.25g/L、牛肉膏3.54g/L、丁二酸钠8.4g/L、磷酸二氢钾0.67g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.01 g/L。最终摇瓶水平发酵培养条件为:初始pH值调至4.2,250 mL三角瓶中装液50 mL,摇床转速为160 rpm,28℃培养9天。在最优条件下的烟曲霉酸产量为68.5 mg/L,为优化之前的4.1倍。进一步研究了菌体形态和供氧量对菌体生物量和烟曲霉酸产量的影响。研究发现烟曲霉菌对剪切力敏感,适当的菌体结球利于菌体生物量和烟曲霉酸的积累,低频超声有利于增加菌体量和提高烟曲霉酸产量;通过调整发酵前期与后期的装液量,发现在发酵前期充足的氧气供应有利于菌体的生物量积累,而发酵后期适当的控氧可促进烟曲霉酸的代谢生产。在摇瓶优化、菌体形态研究和氧气供应考察的基础上,确定了5L反应器上的发酵培养基、搅拌速率和供氧策略。其发酵条件如下:初始pH调整至4.2,搅拌速率设置为300 rpm,在发酵初期空气流量为6 L/min,后期适当将空气流量降低,最终烟曲霉酸的产量为54.81 mg/L。在此基础上,通过桨叶末端线速度相似原则、发酵液溶氧系数相似原则和pH相似原则确定了 500 L反应器中的发酵条件:搅拌速率为80 rpm,发酵初期空气流量为15 m3/h,初始pH调整至4.2,最终烟曲霉酸的产量达到了 41.00 mg/L。

关键词：烟曲霉烟曲霉酸发酵优化菌体形态反应器放大

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绿僵菌生物转化熊果酸生成烟曲霉酸的研究

天然产物研究与开发 2014年第A1期26卷 87-92页

作者：陈燕琼李晓青欧阳文徐鸿陈洪璋曹庸华南农业大学食品学院广州510642 中国科学院深圳先进技术研究院深圳518055

本研究利用波谱学方法对金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）在添加了熊果酸溶液的培养基中生物转化所得的产物进行纯化及结构鉴定，并对其生物转化条件进行正交优化。研究结果表明，金龟子绿僵菌在添加了熊果酸溶液的培养基中生物... 详细信息

本研究利用波谱学方法对金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）在添加了熊果酸溶液的培养基中生物转化所得的产物进行纯化及结构鉴定，并对其生物转化条件进行正交优化。研究结果表明，金龟子绿僵菌在添加了熊果酸溶液的培养基中生物转化所得主要产物为烟曲霉酸，其产量比未添加熊果酸溶液时明显增多，最佳生物转化条件为：培养基pH为6．5，摇床转速为160rpm，反应温度为28℃。

关键词：金龟子绿僵菌熊果酸结构鉴定烟曲霉酸

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曲霉sp.136的化学成分研究(英文)

应用与环境生物学报 2007年第1期13卷 66-68页

作者：秦岭李伯刚官家发张国林中国科学院成都生物研究所中国科学院研究生院北京100039

从曲霉sp.136的固体发酵物中分离得到6个化合物.应用波谱分析及与已知品对照的手段将它们鉴定为烟曲霉酸(1)、(20S,22E,24R)-5α,8α-表二氧-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)、β-谷甾醇(3)、(2S,3S,4R)-2-[(2′R)-2′-羟基二十四烷酰氨基]-... 详细信息

从曲霉sp.136的固体发酵物中分离得到6个化合物.应用波谱分析及与已知品对照的手段将它们鉴定为烟曲霉酸(1)、(20S,22E,24R)-5α,8α-表二氧-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(2)、β-谷甾醇(3)、(2S,3S,4R)-2-[(2′R)-2′-羟基二十四烷酰氨基]-1,3,4-三羟基十八烷(4)、4-羟基苯乙酸(5)和烟碱酸(6).

关键词：曲霉sp.136 烟曲霉酸 4-羟基苯乙酸烟碱酸麦角甾醇

肺泡巨噬细胞体外抗烟曲霉孢子及其代谢产物的电镜观察

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中国皮肤性病学杂志 2009年第4期23卷 196-198页

作者：廖军钟白玉郝飞重庆解放军324医院皮肤科重庆400038 第三军医大学西南医院皮肤科重庆400038

目的通过透射电镜观察烟曲霉孢子及代谢产物对肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬功能形态学的影响。方法以体外培养的Wistar大白鼠PAM为靶细胞,制备烟曲霉孢子悬液和烟曲霉渗析物,用烟曲霉孢子混悬液刺激PAM后,加入烟曲霉蛋白或烟曲霉渗析物,观察PA... 详细信息

目的通过透射电镜观察烟曲霉孢子及代谢产物对肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬功能形态学的影响。方法以体外培养的Wistar大白鼠PAM为靶细胞,制备烟曲霉孢子悬液和烟曲霉渗析物,用烟曲霉孢子混悬液刺激PAM后,加入烟曲霉蛋白或烟曲霉渗析物,观察PAM在吞噬烟曲霉孢子过程中的形态学变化,并与枝霉毒素,烟曲霉素和烟曲霉酸相对照。结果PAM可吞噬烟曲霉孢子,并发生明显的形态学改变。烟曲霉渗析物可抑制PAM对烟曲霉孢子的吞噬,枝霉毒素可诱导PAM发生凋亡。烟曲霉素和烟曲霉酸对PAM吞噬烟曲霉孢子的活动无明显影响作用。结论枝霉毒素和烟曲霉渗析物对PAM有一定的细胞毒性,烟曲霉渗析物能够抑制PAM的吞噬功能,枝霉毒素可诱导其发生凋亡。

关键词：烟曲霉肺泡巨噬细胞枝霉毒素烟曲霉素烟曲霉酸吞噬活性电镜

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

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化学与生物工程 2011年第7期28卷 29-34页

作者：陈苗苗林良才马昱澍王风清魏东芝华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所上海200237

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(***)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD... 详细信息

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(***)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。

关键词：烟曲霉烟曲霉酸 3-甾酮-Δ1-脱氢酶雄甾-4-烯-3,17-二酮雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

真菌Stilbella *** 40422的萜类产物研究

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生物技术进展 2023年第4期13卷 604-611页

作者：宋开南艾羽桐徐玉泉中国农业科学院生物技术研究所北京100081

采用多种硅胶柱色谱、OSD柱色谱与半制备柱高效液相色谱对真菌Stilbella *** 40422大米培养基的发酵产物进行分离提纯,并通过质谱、核磁共振波谱解析等方法对得到的化合物纯品进行结构鉴定。结果显示,从该菌株中分离得到2个原萜烷型四... 详细信息

采用多种硅胶柱色谱、OSD柱色谱与半制备柱高效液相色谱对真菌Stilbella *** 40422大米培养基的发酵产物进行分离提纯,并通过质谱、核磁共振波谱解析等方法对得到的化合物纯品进行结构鉴定。结果显示,从该菌株中分离得到2个原萜烷型四环三萜、1个倍半萜与5个杂萜类化合物,分别为烟曲霉酸、helvolinic acid、tricho-acorenol、ascofuranone、ilicicolin C、LL-Z1272Ɛ、deacetylchloronectrin和ascochlorin N-acetylglucosamine。其中烟曲霉酸的含量最高,随后采用高效液相色谱法测定不同发酵时间发酵物中主产物烟曲霉酸的产量,烟曲霉酸含量在培养15 d后达最大值3 g·kg-1,说明Stilbella *** 40422具有强大的萜类产物生产能力,研究结果为进一步开发萜类化合物生产的底盘细胞奠定了基础。

关键词： Stilbella sp.CGMCC 40422 萜类化合物烟曲霉酸底盘细胞

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