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中华皮肤科杂志 2002年第5期35卷 361-363页

作者：徐赤宇温海吴建华第二军医大学长征医院皮肤科上海200003

目的观察烟曲霉分生孢子静止期及其在膨胀生发过程中表面形态的改变。观察纤连蛋白受体在孢子表面分布状态及其在膨胀生发过程中的变化。方法取培养成熟的烟曲霉,磷酸盐缓冲液冲洗后,通过3.5～4.0μm的钢丝网过滤提取制备纯净分生孢子悬... 详细信息

目的观察烟曲霉分生孢子静止期及其在膨胀生发过程中表面形态的改变。观察纤连蛋白受体在孢子表面分布状态及其在膨胀生发过程中的变化。方法取培养成熟的烟曲霉,磷酸盐缓冲液冲洗后,通过3.5～4.0μm的钢丝网过滤提取制备纯净分生孢子悬液(108细胞/mL)。加入细胞培养液(RPMI1640+10%FBS),分别在0、2、4、6h取材固定,进行扫描电镜观察。另取定量分生孢子悬液(108细胞/mL)孵育在包被有定量纤连蛋白(50μg/mL)的微量测定细胞培养板中,37℃3h;用磷酸盐缓冲液冲洗3次,再分别加入兔抗人-纤连蛋白抗体和羊抗兔IgG-FITC孵育(37℃1h),胰酶消化后冲洗固定立即送共距焦免疫荧光电镜检查。结果静止期分生孢子表面有特征性的小棘状层形式,即有许多刺猬毛状的突起分布在其表面。孢子膨胀生发过程中,刺猬毛样小棘状层结构逐渐降解脱落,大约4h后完全降解脱落。孢子变成由条索状纤维质构成的光滑细胞壁球体;通过共距焦免疫荧光电镜发现FITC均匀地分布粘附在分生孢子表面刺猬毛样棘状突起上。结论静止期分生孢子的表面可表达出高水平纤连蛋白受体。带有放射荧光标记的纤连蛋白配体-受体均匀地分布在静止期分生孢子最外面小棘状层。孢子膨胀过程中表面小棘状层逐渐脱落。

关键词：烟曲霉分生孢子纤连蛋白受体烟曲霉宿主细胞细胞粘附致病性超微结构

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侵袭性曲霉病大鼠生化指标的改变及烟曲霉分生孢子致病力研究

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第二军医大学学报 2004年第4期25卷 414-417页

作者：徐赤宇温海吴建华仇芸陈江汉徐红赵谨第二军医大学长征医院皮肤性病科上海200003

目的 :观察原发侵袭性曲霉大鼠生化指标的改变 ,探讨烟曲霉分生孢子致病性与其表面小棘状层的密切关系。方法 :6 0只大鼠随机均分为免疫抑制组和非免疫抑制组。非免疫抑制组分为实验组和对照组 ,分别接种含或不含胰酶的孢子悬液 ;免疫... 详细信息

目的 :观察原发侵袭性曲霉大鼠生化指标的改变 ,探讨烟曲霉分生孢子致病性与其表面小棘状层的密切关系。方法 :6 0只大鼠随机均分为免疫抑制组和非免疫抑制组。非免疫抑制组分为实验组和对照组 ,分别接种含或不含胰酶的孢子悬液 ;免疫抑制组先注射环磷酰胺和醋酸可的松 ,余处理同非免疫抑制组。观察所有大鼠病理学改变 ,通过内眦静脉采血生化分析、组织器官研磨涂片以及肾脏印模等观察免疫抑制大鼠分生孢子的致病力及菌落生长情况。结果 :非免疫抑制组无明显病理学改变。免疫抑制对照组病理学损伤较实验组严重。在相同培养条件下免疫抑制对照大鼠的肾脏印模、血液培养、肺组织可观察到的烟曲霉多于实验组。血清 TBIL 和 DBIL 在感染后 8h有一过性升高 ,血清 AL P、GGT、TP和 Alb无显著改变 ,L DH、L DH1、CK、CK- MB在 2 h后即有明显升高 ,8～ 2 4 h达到最高峰 ,为对照组的 3～ 6倍 ,4 8～ 72 h后逐渐下降至正常水平。结论 :在烟曲霉感染过程中 ,细胞免疫有很重要的作用。用蛋白质破坏性试剂可除去刺猬毛样小棘状层 ,经过胰酶预处理的烟曲霉分生孢子所引起的原发侵袭性曲霉病大鼠病理与其对照组有显著差异。

关键词：侵袭性曲霉病生化指标烟曲霉分生孢子致病力

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蛋白激酶D1在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用

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南方医科大学学报 2013年第3期33卷 351-355页

作者：牛晓璐许万福李松玉柯志勇曾方银罗深秋邓凡南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室广东广州510515 南方医科大学骨科研究所广东广州510515 南方医科大学南方医院检验科广东广州510515

目的研究蛋白激酶D1(PKD1)在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用,为进一步探讨PKD1在烟曲霉感染引起的肺曲霉病中的作用及其机制奠定基础。方法首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌细胞A549和HEK293细胞中,分... 详细信息

目的研究蛋白激酶D1(PKD1)在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用,为进一步探讨PKD1在烟曲霉感染引起的肺曲霉病中的作用及其机制奠定基础。方法首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/ml)于不同时间处理上述两组细胞,Western blotting证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30 min,分别检测下游NF-κB通路相关信号分子的磷酸化活性;最后,将NF-κB-luc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染入表达GFP、GFP-PKD1的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24 h,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测。结果 Western blotting证实PKD1的过表达时间依赖性地增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKD1的磷酸化活性及NF-κB通路中IКB和p65(pS276)的磷酸化活性,反之,敲低PKD1的表达则抑制烟曲霉介导的NF-κB通路中IКB和p65(pS276)的磷酸化活性。过表达PKD1明显增加NF-κB-luc荧光素酶的转录激活活性。结论 PKD1可能在烟曲霉刺激的NF-κB通路的激活及转录活性中起重要作用。

关键词：蛋白激酶D1 烟曲霉分生孢子 NF-κB 转录激活磷酸化

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烟曲霉诱导的PKD1-NF-κB通路的激活及相关炎症因子的表达调控

烟曲霉诱导的PKD1-NF-κB通路的激活及相关炎症因子的表达调控

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作者：牛晓璐南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种腐生孢子,属于真菌的一种,它对环境中碳和氮原子的循环起着重要作用。自然界中,真菌种类有很多种,烟曲霉菌不是最多的一个种类,但是还是广泛分布于土壤、腐败的植物空气中。它的生殖形式... 详细信息

研究背景：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种腐生孢子,属于真菌的一种,它对环境中碳和氮原子的循环起着重要作用。自然界中,真菌种类有很多种,烟曲霉菌不是最多的一个种类,但是还是广泛分布于土壤、腐败的植物空气中。它的生殖形式是孢子生殖,因此每一个孢子都能产生数以万计的小孢子,然后释放到空气中。这些小孢子直径非常小,能够被人或动物吸入肺泡内。哺乳动物的免疫系统分为天然免疫和适应性免疫,在免疫系统正常的情况下,机体能清除被吸入的烟曲霉分生孢子,使机体免受疾病的困扰。然而,近些年来由于广谱抗生素和器官移植后免疫抑制剂的大量使用,各种严重的真菌感染(包括烟曲霉感染)人群大量增加。其中最常见的为念珠菌的感染,而已有资料表明曲霉菌的感染比例已逐渐赶超念珠菌的感染,并且曲霉菌的感染所造成症状的严重程度更甚。烟曲霉分生孢子可侵袭不同的部位,大部分病人可造成呼吸道感染,根据不同的侵袭部位,可以分为过敏性疾病和侵袭性疾病等等。最严重的就是侵袭性肺曲霉病,这是一种严重的感染,每年可造成高达50%的死亡,烟曲霉和免疫系统的相互作用与疾病密切相关。在1997年发表的《Infection and Immunity》杂志中,印度的Taruna Madan证明了存在于肺上皮中蛋白激酶D通过增加吞噬细胞摄取烟曲霉来抑制烟曲霉的感染。蛋白激酶D是一种具有三个亚型的新的丝氨酸／苏氨酸蛋白质家族,分为PKD1、PKD2、PKD3。有研究表明PKD1在高温放线菌-多孢高温多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)引起的过敏性肺炎中起主要作用,并且PKD1的抑制剂对于治疗这种肺炎是一种非常有效的手段。文章表明PKD家族蛋白酶可能参与调节TLR4和TLR5影响细胞因子的分泌,在人类和脊椎动物中,TLRs家族通过MyD88分子诱导PKD1的激活。但是目前我们不知道,在天然免疫过程中烟曲霉是否能够激活PKD1,并且是否PKDl在烟曲霉诱导的炎症反应中起作用。核因子-кB ((nuclear factor-KB)是一个转录因子,可以受到细胞因子、细菌等刺激而活化,能参与调控肿瘤发生、炎症反应、天然免疫应答等等。大量的证据表明核因子-кB ((nuclear factor-KB)在天然免疫和适应性免疫中都有着不可或缺的作用。有证据表明缺乏NF-кB蛋白的小鼠的体内B细胞和T细胞的增殖与激活,B细胞和T细胞的转变,细胞因子的产生明显受到影响。另有研究证实NF-кB的抑制剂能够抑制树突状细胞的成熟,而树突状细胞是免疫应答的中心环节。正常情况下,Toll样受体可直接或间接的识别进入体内的细菌,被识别后,激活下游的信号分子MyD88,进一步导致受体蛋白TNF受体相关因子6(TRAF6)磷酸化进而激活NF-кB通路。目前PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用尚未见报道,因此本文旨在探讨其作用,并为下一步研究作用机制奠定基础,继而期望能够找到临床上治疗烟曲霉引起的疾病的方法。目的：本研究探讨PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用,为进一步阐明PKD1在烟曲霉感染引起的烟曲霉病中的作用及作用机制奠定基础。方法：首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌上皮细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)于不同时间处理上述两组细胞,Western blot证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30分钟,分别检测下游NF-кB通路相关信号分子的磷酸化活性;最后,将NF-кB-1uc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染入表达GFP、GFP-PKD1的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24小时,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测;过表达或干扰PKD1,在有无烟曲霉分生孢子下刺激24小时,用Trizol法提RNA,用荧光定量PCR的方法检测炎症因子IL-8、TNF-a的变化。结果：1、PKDl过表达时间依赖性的增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKDl的磷酸化活性将外源性的GFP、GFP-PKD1转入A549中,转入24h,检测有过明显表达,然后用灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)分别用不同时间处理A549,结果显示烟曲霉显著增强GFP-PKD1过表达的A549细胞中Ser744/748和Ser916位点的磷酸化活性,并且以时间依赖的方式增强PKD1上Ser744/748和Ser91

关键词： PKD1 烟曲霉分生孢子 NB-κB 转录激活磷酸化

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