烟曲霉诱导的PKD1-NF-κB通路的激活及相关炎症因子的表达调控

作     者：牛晓璐 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗深秋;邓凡

授予年度：2013年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：PKD1 烟曲霉分生孢子 NB-κB 转录激活 磷酸化 

摘      要：研究背景： 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种腐生孢子,属于真菌的一种,它对环境中碳和氮原子的循环起着重要作用。自然界中,真菌种类有很多种,烟曲霉菌不是最多的一个种类,但是还是广泛分布于土壤、腐败的植物空气中。它的生殖形式是孢子生殖,因此每一个孢子都能产生数以万计的小孢子,然后释放到空气中。这些小孢子直径非常小,能够被人或动物吸入肺泡内。 哺乳动物的免疫系统分为天然免疫和适应性免疫,在免疫系统正常的情况下,机体能清除被吸入的烟曲霉分生孢子,使机体免受疾病的困扰。然而,近些年来由于广谱抗生素和器官移植后免疫抑制剂的大量使用,各种严重的真菌感染(包括烟曲霉感染)人群大量增加。其中最常见的为念珠菌的感染,而已有资料表明曲霉菌的感染比例已逐渐赶超念珠菌的感染,并且曲霉菌的感染所造成症状的严重程度更甚。烟曲霉分生孢子可侵袭不同的部位,大部分病人可造成呼吸道感染,根据不同的侵袭部位,可以分为过敏性疾病和侵袭性疾病等等。最严重的就是侵袭性肺曲霉病,这是一种严重的感染,每年可造成高达50%的死亡,烟曲霉和免疫系统的相互作用与疾病密切相关。 在1997年发表的《Infection and Immunity》杂志中,印度的Taruna Madan证明了存在于肺上皮中蛋白激酶D通过增加吞噬细胞摄取烟曲霉来抑制烟曲霉的感染。蛋白激酶D是一种具有三个亚型的新的丝氨酸／苏氨酸蛋白质家族,分为PKD1、PKD2、PKD3。有研究表明PKD1在高温放线菌-多孢高温多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)引起的过敏性肺炎中起主要作用,并且PKD1的抑制剂对于治疗这种肺炎是一种非常有效的手段。文章表明PKD家族蛋白酶可能参与调节TLR4和TLR5影响细胞因子的分泌,在人类和脊椎动物中,TLRs家族通过MyD88分子诱导PKD1的激活。但是目前我们不知道,在天然免疫过程中烟曲霉是否能够激活PKD1,并且是否PKDl在烟曲霉诱导的炎症反应中起作用。 核因子-кB ((nuclear factor-KB)是一个转录因子,可以受到细胞因子、细菌等刺激而活化,能参与调控肿瘤发生、炎症反应、天然免疫应答等等。大量的证据表明核因子-кB ((nuclear factor-KB)在天然免疫和适应性免疫中都有着不可或缺的作用。有证据表明缺乏NF-кB蛋白的小鼠的体内B细胞和T细胞的增殖与激活,B细胞和T细胞的转变,细胞因子的产生明显受到影响。另有研究证实NF-кB的抑制剂能够抑制树突状细胞的成熟,而树突状细胞是免疫应答的中心环节。正常情况下,Toll样受体可直接或间接的识别进入体内的细菌,被识别后,激活下游的信号分子MyD88,进一步导致受体蛋白TNF受体相关因子6(TRAF6)磷酸化进而激活NF-кB通路。目前PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用尚未见报道,因此本文旨在探讨其作用,并为下一步研究作用机制奠定基础,继而期望能够找到临床上治疗烟曲霉引起的疾病的方法。 目的： 本研究探讨PKD1在烟曲霉介导的NF-кB通路的激活及转录活性中的作用,为进一步阐明PKD1在烟曲霉感染引起的烟曲霉病中的作用及作用机制奠定基础。 方法： 首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌上皮细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)于不同时间处理上述两组细胞,Western blot证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30分钟,分别检测下游NF-кB通路相关信号分子的磷酸化活性;最后,将NF-кB-1uc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染入表达GFP、GFP-PKD1的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24小时,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测;过表达或干扰PKD1,在有无烟曲霉分生孢子下刺激24小时,用Trizol法提RNA,用荧光定量PCR的方法检测炎症因子IL-8、TNF-a的变化。 结果： 1、PKDl过表达时间依赖性的增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKDl的磷酸化活性 将外源性的GFP、GFP-PKD1转入A549中,转入24h,检测有过明显表达,然后用灭活的烟曲霉分生孢子(1×105CFU/mL)分别用不同时间处理A549,结果显示烟曲霉显著增强GFP-PKD1过表达的A549细胞中Ser744/748和Ser916位点的磷酸化活性,并且以时间依赖的方式增强PKD1上Ser744/748和Ser91