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灵猫方调控HBV相关免疫应答的机制研究

中西医结合肝病杂志 2023年第12期33卷 1087-1091页

作者：崔怡朱晓骏尚志方淼唐亦非高月求上海中医药大学附属曙光医院上海201203 上海中医药大学曙光临床医学院

目的:通过蛋白质组学技术及组织病理学观察并验证灵猫方调控HBV相关免疫应答的作用及机制。方法:将30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、灵猫方组,每组10只。除正常组外,其余小鼠采用水动力转染技术建立HBV体内复制模型,... 详细信息

目的:通过蛋白质组学技术及组织病理学观察并验证灵猫方调控HBV相关免疫应答的作用及机制。方法:将30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、灵猫方组,每组10只。除正常组外,其余小鼠采用水动力转染技术建立HBV体内复制模型,灵猫方组小鼠给予灵猫方灌胃,2次/d,模型组和正常组小鼠给予等体积饮用水,连续灌胃3 d。Elisa检测分析小鼠血清HBsAg、HBeAg、IFNα含量,IHC染色观察小鼠肝组织F4/80表达,实时荧光定量PCR检测小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子的含量,高通量蛋白质组学技术检测小鼠肝脏免疫细胞蛋白质表达,筛选差异表达的信号通路。结果:与模型组比较,灵猫方组小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度明显下降(P灵猫方组小鼠差异蛋白显著富集于代谢相关功能;KEGG分析显示,差异蛋白显著富集于PPAR通路;差异蛋白表达定量分析显示,与模型组相较,灵猫方组小鼠免疫细胞的代谢能力下降,天然免疫应答上升。结论:灵猫方可能通过作用于PPAR信号通路,参与免疫细胞脂质代谢重编程,进而增强HBV相关免疫应答,同时抑制促炎因子的释放。

关键词：灵猫方乙型肝炎病毒免疫应答

灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的机制研究

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灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的机制研究

作者：郭若闻上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:研究灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的免疫机制。方法:1.观察α-Galcer急性肝损伤小鼠模型的中性粒细胞浸润情况:（1）分组:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（以下称对照组）、3h模型组、9h模型组、16h... 详细信息

目的:研究灵猫方抑制中性粒细胞浸润及活化预防急性肝损伤的免疫机制。方法:1.观察α-Galcer急性肝损伤小鼠模型的中性粒细胞浸润情况:（1）分组:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（以下称对照组）、3h模型组、9h模型组、16h模型组、24h模型组,每组10只。（2）给药方法:经小鼠尾静脉一次性注射α-Galcer（100mg/kg体重）,建立急性肝损伤模型,分别于注射3h、9h、16h、24h后处死。（3）各指标检测方法:赖氏法检测血清ALT、AST表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理变化情况;免疫组化法检测肝脏中性粒细胞的浸润情况;微量样本多指标流式蛋白定量技术检测小鼠血清细胞因子和趋化因子的表达水平。2.灵猫方通过抑制中性粒细胞浸润及活化预防α-Galcer模型小鼠急性肝损伤的机制:（1）分组:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型对照组（以下称模型组）、中药低剂量预防组（以下称低剂量组）、中药中剂量预防组（以下称中剂量组）、中药高剂量预防组（以下称高剂量组）,每组10只。（2）给药方法:低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠,分别按照5ml/kg、10ml/kg、20ml/kg体重给予灵猫方灌胃,每天一次,连续七天;第七天灌胃后,经小鼠尾静脉一次性注射α-Galcer（100mg/kg体重）,16h后处死。（3）各指标检测方法:赖氏法检测血清ALT、AST表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理变化情况;免疫组化法检测肝脏中性粒细胞的浸润情况;微量样本多指标流式蛋白定量技术检测血清细胞因子及趋化因子的表达水平;Real-Time PCR法检测肝组织Ly6G m RNA表达水平;Western Blot法检测肝组织p-AKT/AKT、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK,p-P38/P38信号分子的表达水平;流式细胞术检测肝脏中性粒细胞ROS的表达水平;ELISA法检测肝组织MDA和4-HNE的表达水平。结果:1.α-Galcer急性肝损伤小鼠模型中性粒细胞的浸润情况:与正常组相比,16h模型组、24h模型组血清ALT、AST水平明显上升（P＜0.001）,16h模型组、24h模型组可见肝组织片状坏死,各模型组肝内浸润的MPO阳性中性粒细胞数量增多且16h模型组最多（P＜0.001）,16h模型组血清促炎因子IFN-γ表达最强（P＜0.001）,血清趋化因子检测9h模型组血清趋化因子Eotaxin、RANTS明显增加（P＜0.001）,3h模型组血清趋化因子KC明显增加（P＜0.001）。2.灵猫方通过抑制中性粒细胞浸润及活化预防α-Galcer模型小鼠急性肝损伤的机制研究:（1）灵猫方对急性肝损伤小鼠肝脏病理改变的预防作用:与正常组相比,模型组血清ALT、AST表达水平明显升高（P＜0.001）,模型组肝组织片状坏死、周围出现大量炎症细胞浸润;与模型组相比,高剂量组血清ALT、AST水平明显降低（P＜0.001）,高剂量组肝组织片状坏死减少、炎症细胞浸润面积缩小。（2）灵猫方对小鼠肝内中性粒细胞浸润的调节作用:与正常组相比,模型组肝脏内浸润的MPO阳性中性粒细胞数量增加（P＜0.01）,肝组织Ly6G m RNA表达上升（P＜0.05）,肝组织MDA和4-HNE表达水平明显上升（P＜0.001）;与模型组相比,中剂量组和高剂量组MPO阳性中性粒细胞数量减少（P＜0.01）,高剂量组Ly6G m RNA表达下降（P＜0.05）,高剂量组MDA和4-HNE表达降低（P＜0.05）。（3）灵猫方对小鼠肝脏炎症相关细胞因子和趋化因子的调节作用:与正常组小鼠相比,模型组肝组织细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2表达水平明显升高（P＜0.001）,模型组肝组织趋化因子RANTES、KC、BLC表达水平明显升高（P＜0.001）;与模型组相比,高剂量组促炎因子IFN-γ、IL-2表达水平明显降低（P＜0.001）,高剂量组趋化因子RANTES、KC表达水平明显降低（P＜0.005）。（4）灵猫方对小鼠肝脏炎症相关信号通路的调节作用:与正常组相比,模型组小鼠肝脏p-ERK、p-JNK、p-P38、p-AKT表达水平升高（P＜0.05）;与模型组相比,高剂量组p-ERK、p-JNK、p-AKT表达水平降低（P＜0.05）。结论:1.灵猫方通过抑制α-Galcer急性肝损伤模型小鼠体内中性粒细胞的浸润,预防急性肝损伤。2.灵猫方通过减少肝脏ROS、MDA、4-HNE的表达水平,抑制浸润肝脏的中性粒细胞的氧化应激反应,预防急性肝损伤。3.灵猫方通过减少促炎因子IL-2、IL-5的表达,减少中性粒细胞相关趋化因子KC、MCP-1和巨噬细胞相关趋化因子MDC、TARC的表达,抑制了肝脏内中性粒细胞的浸润和集聚,预防急性肝损伤。

关键词：急性肝损伤中性粒细胞灵猫方氧化应激细胞因子趋化因子

灵猫方及其单味药醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原表达的影响

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河北中医 2017年第5期39卷 729-734页

作者：张鑫张晞文丁俊孙学华李曼周振华高亚婷金树根高月求上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室上海201203 上海中医药大学附属曙光医院胰胆外科上海2012032 上海中医药大学附属曙光医院肝病科上海201203

目的研究灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿、猫爪草、生黄芪)醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达的影响。方法制备灵猫方及其7种单味药的醇提物,分别配制成50、100、200、... 详细信息

目的研究灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿、猫爪草、生黄芪)醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达的影响。方法制备灵猫方及其7种单味药的醇提物,分别配制成50、100、200、400μg/mL4个浓度,作用于HepG2.2.15细胞72h,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测药物的细胞毒性;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg水平。结果灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用,且抑制率随药物浓度的递增而增加(P灵猫方醇提取物及组分的牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿醇提取物能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达。

关键词：胞质,代谢肝炎e抗原,乙型肝炎表面抗原,乙型灵猫方

灵猫方联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者的疗效及对NK细胞功能的影响

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上海中医药大学学报 2017年第2期31卷 16-21页

作者：江云高月求李曼张鑫周振华上海中医药大学附属曙光医院肝病科上海201203

目的:观察灵猫方联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床疗效及其对患者外周血自然杀伤细胞(NK)数量、功能的影响,探讨灵猫方治疗CHB的免疫调节机制。方法:纳入54例符合标准的CHB患者,随机分为单用组27例和联合组27例,同时纳入10... 详细信息

目的:观察灵猫方联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床疗效及其对患者外周血自然杀伤细胞(NK)数量、功能的影响,探讨灵猫方治疗CHB的免疫调节机制。方法:纳入54例符合标准的CHB患者,随机分为单用组27例和联合组27例,同时纳入10例健康志愿者作为健康对照组。两组均给予口服替比夫定治疗,联合组加服灵猫方,疗程为24周。治疗3个月、6个月时,评价两组患者的中医证候积分,检测两组患者的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、HBV-DNA定量、HbeAg、外周血NK细胞数量及细胞表面和胞内Toll样受体(TLRs)的表达水平,比较两组患者的ALT、AST复常率,HBV-DNA阴转率和HBeAg血清转换率。结果:治疗3个月、6个月后,两组患者的中医证候积分较治疗前均显著降低(P0.05)。与健康对照组比较,CHB患者的外周血NK细胞数量明显减少(P灵猫方联合替比夫定可显著改善CHB患者的中医证候和肝功能,灵猫方的作用机制可能与提高患者的NK细胞数量及其胞内外TLR3的表达水平,从而调节机体的免疫功能有关。

关键词：灵猫方替比夫定慢性乙型肝炎 NK细胞 TLR3 TLR9

灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎临床研究

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上海中医药大学学报 2012年第6期26卷 42-44页

作者：孙学华朱晓骏高月求杨婉凤李曼周振华李璐刘顺庆姚军楼微微上海中医药大学附属曙光医院肝病科上海201203

目的:探讨灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎(1×ULN≤ALT≤2×ULN)的临床疗效。方法:采用随机、双盲、安慰剂对照的方法,将56例患者分为治疗组28例和对照组28例。治疗组给予灵猫方联合恩替卡韦治疗,对照组给予安慰剂联合恩替卡韦治疗... 详细信息

目的:探讨灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎(1×ULN≤ALT≤2×ULN)的临床疗效。方法:采用随机、双盲、安慰剂对照的方法,将56例患者分为治疗组28例和对照组28例。治疗组给予灵猫方联合恩替卡韦治疗,对照组给予安慰剂联合恩替卡韦治疗,疗程为12个月。观察两组患者的临床疗效及血清HBV-DNA、HBeAg、HBsAg水平的变化。结果:治疗后,治疗组和对照组的总有效率分别为92.86%和89.29%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗组患者的HBV-DNA、HBsAg、HBeAg下降幅度明显大于对照组(P灵猫方联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎(1×ULN≤ALT≤2×ULN),在抑制乙肝病毒复制,降低HBsAg、HBeAg的表达方面优于单用恩替卡韦。

关键词：灵猫方慢性乙型肝炎(轻度) 随机对照试验

灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞La蛋白表达的影响

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上海中医药杂志 2017年第1期51卷 88-91页

作者：朱晓骏张鑫李曼周振华金树根唐亦非孙学华高月求上海中医药大学附属曙光医院肝病科上海201203 上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室上海201203

目的研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制。方法制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9%Na Cl溶液作... 详细信息

目的研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制。方法制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9%Na Cl溶液作为空白对照组,6 d后收集培养液上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和LamRNA表达水平。结果与空白对照组比较,灵猫方组的HepG2.2.15和HepAD38细胞的HBsAg和HBeAg分泌水平明显降低,细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和LamRNA表达水平明显降低(P灵猫方可能通过抑制HepG2.2.15和HepAD38细胞内La蛋白的表达而促进pgRNA、sRNA和cccDNA的降解,从而抑制HBV的复制。

关键词：灵猫方 HepG2.2.15 HepAD38 La蛋白 pgRNA cccDNA sRNA

灵猫方及其单味药对hepG2.2.15细胞乙肝病毒蛋白影响的研究

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灵猫方及其单味药对hepG2.2.15细胞乙肝病毒蛋白影响的研究

灵猫方及其单味药对hepG2.2.15细胞乙肝病毒蛋白影响的研究

第二十四届全国中西医结合消化系统疾病学术会议

作者：高月求何林蔓李曼孙学华朱晓骏上海中医药大学附属曙光医院肝病科

目的:研究灵猫方全方及其组成单味药(猫爪草、猫人参、淫羊藿、青皮、牡丹皮、黄芪、胡黄连)提取物对hepG2.2.15细胞的乙肝病毒蛋白表达的影响。方法:制备灵猫方全方及其组方中的7味中药的提取物,分别配制成为400μg/ml、200μg/ml、100... 详细信息

目的:研究灵猫方全方及其组成单味药(猫爪草、猫人参、淫羊藿、青皮、牡丹皮、黄芪、胡黄连)提取物对hepG2.2.15细胞的乙肝病毒蛋白表达的影响。方法:制备灵猫方全方及其组方中的7味中药的提取物,分别配制成为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml四种浓度,作用于hepG2.2.15细胞72小时,MTT法检测药物对细胞的毒性,ELISA方法检测中药对hepG2.2.15细胞表达的HBsAg、HBeAg水平的影响。结果:灵猫方全方提取物对hepG2.2.15细胞表达HBsAg、HBeAg的治疗指数(TI)分别为13.5、52.8;猫人参提取物对HBsAg的TI为2.829;淫羊藿提取物对HBsAg的TI为2.93:牡丹皮提取物对HBsAg的TI为1.56;青皮提取物对HBsAg、HBeAg的TI分别为9.6、6.3;胡黄连提取物对HBsAg、HBeAg的TI分别为2.88、2.14。结论:灵猫方全方提取物及猫人参、淫羊藿、牡丹皮、青皮、胡黄连提取物对hepG2.2.15细胞表达的HBsAg、HBeAg有明显的抑制作用。

关键词：灵猫方 hepG2.2.15 HBeAg HBsAg

来源： cnki会议评论

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灵猫方及其单味药对hepG2.2.15细胞乙肝病毒蛋白影响的研究

基于网络药理学和动物实验研究灵猫方治疗慢性乙型肝炎的机制

第二十一次全国中西医结合肝病学术会议

作者：高月求何林蔓李曼孙学华朱晓骏上海中医药大学附属曙光医院肝病科

目的:研究灵猫方全方及其组成单味药(猫爪草、猫人参、淫羊藿、青皮、牡丹皮、黄芪、胡黄连)提取物对hepG2.2.15细胞的乙肝病毒蛋白表达的影响。方法:制备灵猫方全方及其组方中的7味中药的提取物,分别配制成为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml四种浓度,作用于hepG2.2.15细胞72小时,MTT法检测药物对细胞的毒性,ELISA方法检测中药对hepG2.2.15细胞表达的HBsAg、HBeAg水平的影响。结果:灵猫方全方提取物对hepG2.2.15细胞表达HBsAg、HBeAg的治疗指数(TI)分别为13.5、52.8;猫人参提取物对HBsAg的TI为2.829;淫羊藿提取物对HBsAg的TI为2.93;牡丹皮提取物对HBsAg的TI为1.56;青皮提取物对HBsAg、HBeAg的TI分别为9.6、6.3;胡黄连提取物对HBsAg、HBeAg的TI分别为2.88、2.14。结论:灵猫方全方提取物及猫人参、淫羊藿、牡丹皮、青皮、胡黄连提取物对hepG2.2.15细胞表达的HBsAg、HBeAg有明显的抑制作用。

关键词：灵猫方 hepG2.2.15 HBeAg HBsAg

来源： cnki会议评论

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临床肝胆病杂志 2022年第7期38卷 1503-1508页

作者：马利节朱晓骏林佳成王芳孙学华高月求上海中医药大学曙光临床医学院上海201203 上海中医药大学附属曙光医院肝炎科上海201203

目的探讨灵猫方治疗慢性乙型肝炎与Ⅰ型IFN的相关性。方法TCMSP数据库筛选灵猫方主要活性成分;Genecards数据库获取灵猫方、慢性乙型肝炎作用靶点;Bioinformatics获取药物与疾病靶点交集、绘制韦恩图、并进行GO富集分析;DAVID 6.8进行K... 详细信息

目的探讨灵猫方治疗慢性乙型肝炎与Ⅰ型IFN的相关性。方法TCMSP数据库筛选灵猫方主要活性成分;Genecards数据库获取灵猫方、慢性乙型肝炎作用靶点;Bioinformatics获取药物与疾病靶点交集、绘制韦恩图、并进行GO富集分析;DAVID 6.8进行KEGG富集分析;CytoScape 3.8.0进行免疫过程分析。30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠,随机分为正常组、模型组、灵猫方组,每组10只,除正常组10只外,余20只采用水动力转染技术建立HBV体内复制模型,灵猫方灌胃3 d,2次/d,模型组、正常组同体积生理盐水灌胃。结束后收集血清样本,ELISA检测HBsAg、HBeAg、Ⅰ型IFN水平变化。计量资料两组间比较采用独立样本t检验,组间多重比较采用One-way ANOVA结合最小显著性差异法LSD进行多重比较分析。结果网络药理学获取灵猫方22个活性成分、6059个作用靶点,481个慢性乙型肝炎相关靶点,387个药物-疾病交集靶点,并提出灵猫方通过调控Ⅰ型IFN参与乙型肝炎相关免疫应答的假设。动物实验证实与模型组比较,灵猫方组HBsAg(t=2.227,P=0.043)、HBeAg(t=2.488,P=0.026)显著下降,且HBsAg(t=-4.603,P0.05),灵猫方组IFNα、IFNβ水平显著上升(P值均灵猫方组IFNα、IFNβ水平亦显著上升(P值均灵猫方通过调控Ⅰ型IFN的分泌,达到抗HBV的作用。

关键词：乙型肝炎,慢性灵猫方网络药理学动物实验干扰素Ⅰ型