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漆酶活性对石油污染土壤特性和微生物活性的影响

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石油学报（石油加工） 2017年第5期33卷 992-997页

作者：郑红婷钟哲森张秀霞李振伟尚琼琼中国石油大学化学工程学院环境与安全工程系山东青岛266580

对土壤的石油污染问题进行分析,通过30d的花盆模拟实验,研究了不同漆酶活性对石油污染土壤特性及石油烃降解等土壤微生物活性的影响。结果表明:当土壤中漆酶活性为12U/g时,石油烃降解效果最佳,修复30d后石油烃降解率达到19.00%,比不调... 详细信息

对土壤的石油污染问题进行分析,通过30d的花盆模拟实验,研究了不同漆酶活性对石油污染土壤特性及石油烃降解等土壤微生物活性的影响。结果表明:当土壤中漆酶活性为12U/g时,石油烃降解效果最佳,修复30d后石油烃降解率达到19.00%,比不调节漆酶活性的对照组提高了10.50百分点;漆酶活性提高有利于土壤持水性能保持,可以促进微生物的生长代谢及土壤中脱氢酶、过氧化氢酶的活性,进而促进石油污染土壤的生物修复效果。

关键词：石油污染土壤漆酶活性生物修复石油烃降解

香菇转录因子LeZNF143响应高温胁迫的功能分析

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菌物学报 2024年

作者：王梅宋婷婷蔡为明曲英敏范丽军胡心柔金群力浙江省农业科学院园艺研究所

高温胁迫是影响香菇生长发育的非生物胁迫之一，转录因子在调节香菇对高温胁迫的防御反应中起着至关重要的作用。本研究测定了15个香菇品种高温胁迫后菌丝恢复生长的速度，从中筛选出了高温耐受型菌株NKY-5和敏感型菌株NKY-11。定量结... 详细信息

高温胁迫是影响香菇生长发育的非生物胁迫之一，转录因子在调节香菇对高温胁迫的防御反应中起着至关重要的作用。本研究测定了15个香菇品种高温胁迫后菌丝恢复生长的速度，从中筛选出了高温耐受型菌株NKY-5和敏感型菌株NKY-11。定量结果显示，C2H2型转录因子LeZNF143在菌丝体中高表达，高温胁迫下，菌株NKY-5中LeZNF143基因诱导表达显著高于NKY-11；亚细胞定位显示LeZNF143定位在细胞核中；将香菇转录因子LeZNF143在酵母中过表达，显著提高了酵母对高温胁迫的耐受性，推测转录因子LeZNF143参与调控香菇响应高温胁迫。通过JASPAR数据库预测LeZNF143的下游靶基因为漆酶基因（Lcc4/Lcc7/Lcc11），高温胁迫下，香菇体内漆酶活性显著增高，耐受型菌株NKY-5的漆酶活性显著高于敏感型菌株NKY-11。综上所述，转录因子LeZNF143可能通过调控下游漆酶的活性提高香菇对热胁迫介导的氧化应激的耐受性。

关键词：香菇高温胁迫 C2H2型转录因子酵母表型漆酶活性

高产漆酶革耳的分离鉴定、培养条件、液体发酵及偶氮染料脱色

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应用与环境生物学报 2022年第3期28卷 699-704页

作者：李小凤韩鹏陈青君赵智靖徐诗毅王秋颖关体坤张国庆北京农学院生物与资源环境学院农业农村部华北都市农业重点实验室北京102206 北京农学院植物科学技术学院北京农学院林木分子设计育种高精尖创新中心农业应用新技术北京市重点实验室北京102206

漆酶能够高效降解木质素、酚类、胺类等难降解化合物,在造纸、纺织、环保等诸多领域具有良好应用前景.以采集自广西十万大山国家森林公园的高产漆酶革耳属真菌为材料,开展分类鉴定、菌丝最适培养条件、液体发酵产漆酶条件以及染料脱色... 详细信息

漆酶能够高效降解木质素、酚类、胺类等难降解化合物,在造纸、纺织、环保等诸多领域具有良好应用前景.以采集自广西十万大山国家森林公园的高产漆酶革耳属真菌为材料,开展分类鉴定、菌丝最适培养条件、液体发酵产漆酶条件以及染料脱色活性研究.结合形态鉴定与ITS鉴定,确定目标菌株F1625为野生革耳(Panus rudis);结合生长速度和长势,菌丝生长最适碳源为葡萄糖,氮源为酵母浸粉,碳氮比为10/1-20/1,生长因子为维生素B_(1)或维生素C,pH为6-8,温度为32℃,该菌株为高温菌株.液体发酵产漆酶研究表明,PD培养基优于菌丝最适培养条件培养基,Cu^(2+)对产漆酶有抑制作用,而愈创木酚能够诱导漆酶表达.PD培养基添加3.20 mmol/L愈创木酚,在144 h时达到最大酶活,为(4.59±0.04)×10^(3)U/L.F1625菌株发酵液对偶氮染料脱色效果显著,24 h对伊文思蓝和铬黑T的脱色率分别为60.83%±1.40%和65.03%±0.67%.本研究表明F1625菌株在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值.(图7参26)

关键词：革耳鉴定培养条件漆酶活性染料脱色

梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

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菌物学报 2020年第6期39卷 1139-1151页

作者：刘天海张强苗人云唐杰张小平黄忠乾彭卫红谭昊四川省农业科学院土壤肥料研究所四川省农业科学院食用菌研究中心四川成都610066 四川农业大学资源学院微生物学系四川成都611130 江南大学生物工程学院江苏无锡214062 农业部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站四川成都610066

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族),而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1... 详细信息

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族),而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA12家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA12家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA12多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64k Da,表现出亚铁氧化酶(EC1.***.3.1)与漆酶(EC1.***.3.2)双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn^2+、Hg^2+和Pb^2+抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA12家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。

关键词： AA12家族多铜氧化酶异源表达纯化漆酶活性亚铁氧化酶活性

草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

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微生物学报 2014年第7期54卷 828-835页

作者：吴林阳经慧陈明杰汪虹鲍大鹏国家食用菌工程技术研究中心、农业部南方食用菌资源利用重点实验室、上海市农业遗传育种重点开放实验室、上海市农业科学院食用菌研究所上海201403 西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA... 详细信息

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。

关键词：草菇漆酶基因异源表达漆酶活性

Enhancement of Laccase Activity by Marine-derived Deuteromycete Pestalotiopsis sp. J63 with Agricultural Residues and Inducers

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Chinese Journal of Chemical Engineering 2013年第10期21卷 1182-1189页

作者：冯晓雨陈慧英薛栋升姚善泾 Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education Department of Chemical and Biologi-cal Engineering Zhejiang University Hangzhou 310027 China

Pestalotiopsis sp. J63, producing a high activity of laccase, is a new marine-derived fungus isolated from the oceanic sediment of the East China Sea. Since the marine environment is oligotrophic nutrient, marine derived fungi may use small amount of nutrients to grow and produce laccases. Agricultural residues that are mainly composed of lignin, cellulose and hemicellulose are difficult to be degraded and few microbes can take them as substrates, so they are considered as oligotrophic nutrient and have the potential to be used to produce value added products. In this study, the ability of Pestalotiopsis sp. J63 to use agricultural residues to produce laccases was tested in the submerged fermentation. The combination of 3 g·L 1maltose and 20 g·L 1rice straw was the best carbon sources and 8 g·L 1ammonium sulfate was the best nitrogen source under the condition without inducers. The effects of five inducers, the feeding time and concentration of inducer on laccase production were investigated.Adding 0.09 mmol·L 1phenol after 24 h of incubation led to high laccase activity(5089 U·L 1), while with 0.09mmol·L 1phenol in the medium and wheat bran as the nitrogen source, the laccase activity could reach 5791.7U·L 1. Native-PAGE results showed that two laccase isozymes were present in the cultures. One existed in both induced and non-induced culture filtrates, while the other was only found in the fermentation with the addition of phenol, guaiacol and veratryl alcohol.

关键词：海洋沉积物漆酶活性农业废弃物诱导剂藻半纤维素发酵试验农业残余物

蒽对3株灵芝菌株漆酶活性及其转录表达水平的影响

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生物技术通报 2019年第9期35卷 112-117页

作者：胡楚霄雷善钰秦艳平赵奕锦向泉桔四川农业大学资源学院微生物系

探索多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)蒽对不同灵芝菌株漆酶活性及其转录表达的影响。以 3 株灵芝菌株(美芝、荣保 1 号和川芝)为实验材料,避光静置培养 5 d 后,加入终浓度为 1.0 mg/L 的蒽,避光处理 1 h、3 h、6 h、9... 详细信息

探索多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)蒽对不同灵芝菌株漆酶活性及其转录表达的影响。以 3 株灵芝菌株(美芝、荣保 1 号和川芝)为实验材料,避光静置培养 5 d 后,加入终浓度为 1.0 mg/L 的蒽,避光处理 1 h、3 h、6 h、9 h 和 24 h,收集上清液测定漆酶活性,菌丝体样品提取 RNA,分析多环芳烃蒽对漆酶活性和转录表达水平的影响。结果显示,蒽对 3 株菌株的漆酶活性及转录表达水平的影响均存在差异。3 株灵芝菌株中,川芝的漆酶活性最高,美芝次之,荣保 1 号酶活最低。荣保 1 号漆酶活性随着处理时间的延长而上升,培养前期活性被为抑制,后期则被促进;美芝漆酶活性变化趋势类似于荣保 1 号,变化幅度较小;川芝漆酶活性受到强烈抑制,且随着时间的变化差异不明显。蒽处理下,美芝漆酶基因转录表达水平差异较小,大部分基因在处理 9 h 后出现转录表达水平峰值;荣保 1 号漆酶基因的表达水平类似于美芝;川芝漆酶在短期处理下,转录表达水平大幅上调,随着处理时间的延长,转录表达水平下调。3 株灵芝菌株漆酶活性和漆酶基因转录表达水平对蒽的响应各不相同,其中川芝较敏感,荣保 1 号次之,美芝变化幅度最小,耐受力最强。

关键词：蒽灵芝转录表达漆酶活性

液体培养条件下槐生多年卧孔菌、微酸多年卧孔菌和白蜡多年卧孔菌的抗氧化活性研究

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菌物学报 2017年第2期36卷 229-241页

作者：李海蛟孟歌郑飞员瑗司静中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所北京100050 北京林业大学微生物研究所北京100083

槐生多年卧孔菌Perenniporia robiniophila、微酸多年卧孔菌Perenniporia subacida和白蜡多年卧孔菌Perenniporia fraxinea均属于药用真菌,具有较高的应用价值。本研究将这3种药用真菌进行液体培养,测定此过程中的漆酶活性、多酚含量、... 详细信息

槐生多年卧孔菌Perenniporia robiniophila、微酸多年卧孔菌Perenniporia subacida和白蜡多年卧孔菌Perenniporia fraxinea均属于药用真菌,具有较高的应用价值。本研究将这3种药用真菌进行液体培养,测定此过程中的漆酶活性、多酚含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T‐AOC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性、抑制羟自由基能力(restraining ability to hydroxyl free radicals,RAHFR)和1,1‐二苯基‐2‐三硝基苯肼(1,1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力。结果显示,所选取的3种多年卧孔菌均具有抗氧化活性,且该活性与菌株自身的生长状况、次级代谢产物分泌及降解酶活性等密切相关。其中,微酸多年卧孔菌分泌的漆酶活性最高,出现峰值时间最早,第6天时酶活可达2.51U/m L。槐生多年卧孔菌在液体培养过程中分泌多酚、T‐AOC和CAT的能力最强,于第2天、第12天和第8天时分别达1.54mg/m L、2.59U/m L和7.71U/m L。此外,该菌株对羟自由基及DPPH自由基的清除能力也较强,在第10天和第2天分别为78.42U/m L和26.65%。而白蜡多年卧孔菌仅分泌SOD的能力最强,第2天时酶活为1.87U/m L。相比之下,3种多年卧孔菌中尤其以槐生多年卧孔菌的抗氧化活性最高,微酸多年卧孔菌次之,最后是白蜡多年卧孔菌。

关键词：槐生多年卧孔菌微酸多年卧孔菌白蜡多年卧孔菌药用真菌漆酶活性抗氧化活性

茶树菇遗传转化体系构建及木质素分解酶Lac基因家族功能分析

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茶树菇遗传转化体系构建及木质素分解酶Lac基因家族功能分析

作者：崔祥华西南林业大学

学位级别：硕士

本文以食药用真菌茶树菇(Agrocybe aegerita)为研究材料,建立稳定的遗传转化体系,筛选出高效适宜的启动子,构建高效表达的通用载体;通过对茶树菇全基因组测序并进行序列比对,通过PCR扩增得到相应的9种漆酶基因,以PEG介导的原生质体遗传... 详细信息

本文以食药用真菌茶树菇(Agrocybe aegerita)为研究材料,建立稳定的遗传转化体系,筛选出高效适宜的启动子,构建高效表达的通用载体;通过对茶树菇全基因组测序并进行序列比对,通过PCR扩增得到相应的9种漆酶基因,以PEG介导的原生质体遗传转化手段将漆酶片段转入高表达载体得到漆酶高表达转化子;通过q RT-PCR技术测得各转化子漆酶表达量,液体培养得到其粗酶液,采用分光光度法测其酶活以及在不同生理生化条件下的漆酶活性,为茶树菇的营养生理及遗传研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)构建了茶树菇的遗传转化体系:以茶树菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因(hph)作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因,应用PEG介导法构建了茶树菇遗传转化体系。结果表明,150μg/m L潮霉素可以完全抑制茶树菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3 h,原生质体得率最高。通过PEG介导将DNA片段转化入茶树菇原生质体后,获得的转化子经潮霉素筛选、PCR验证和荧光显微镜观察,证明外源基因hph和egfp已成功转入茶树菇中并获得稳定表达。(2)高效表达体系的建立:克隆actin、gpd和Pumgpd不同长度5个启动子片段,替换原有的启动子,对靶标基因的表达量进行分析。依据actin基因启动子构建的载体p Aa-actin-1和p Aa-actin-2获得转化子中,靶标基因表达量为对照3倍以上转化子数量分别为50%和33.33%,最高表达量分别为对照的10.45和6.23倍;携带p Aa-gpd-1、p Aa-gpd-2和p Aa-Pumgpd启动子的载体获得的转化子中,表达量为对照3倍以上的数量分别为0、28.57%和25%,最高表达量分别为对照的2.93、7.75和4.31倍。actin启动子获得高表达转化子得率较gpd和Pumgpd启动子片段高,适用于茶树菇转化体系构建。(3)YSG菌株漆酶基因家族的序列特征及过量表达转化子的酶活性分析:通过基因组注释信息及序列分析,共得到9个漆酶基因。克隆全长后连接到高效表达载体。通过q RT-PCR测定各漆酶转化子的表达量后,分别挑选高效表达转化子,以2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(简称ABTS)、愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚为底物,比较9种漆酶过量表达菌株漆酶活性,以Cu、K、Na、Mn、Ca、Fe、Fe、Mg、Zn为底物,研究9种金属离子对漆酶活性的影响,以2.8、3.3、3.8、4.3、4.8、5.3、5.8不同p H环境探究p H对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响,探究不同浓度漆酶酶活抑制剂EDTA对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响。结果发现,茶树菇内漆酶可能为酸性蛋白酶类,酶促反应的最适底物是ABTS;Cu对漆酶酶活有着促进作用,除K、Zn、Na对个别漆酶基因酶活有着促进作用外,其他金属离子对漆酶酶活均为抑制作用,探讨了不同底物与不同金属离子对漆酶催化反应的影响。(4)漆酶基因家族基因过量表达菌株对基质和生长发育的影响:与野生菌株YSG相比,漆酶基因过表达转化子出菇较早。

关键词：茶树菇过量表达 PEG介导转化启动子筛选漆酶活性