茶树菇遗传转化体系构建及木质素分解酶Lac基因家族功能分析

作     者：崔祥华 

作者单位：西南林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李靖;陈卫民

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：茶树菇 过量表达 PEG介导转化 启动子筛选 漆酶活性 

摘      要：本文以食药用真菌茶树菇(Agrocybe aegerita)为研究材料,建立稳定的遗传转化体系,筛选出高效适宜的启动子,构建高效表达的通用载体;通过对茶树菇全基因组测序并进行序列比对,通过PCR扩增得到相应的9种漆酶基因,以PEG介导的原生质体遗传转化手段将漆酶片段转入高表达载体得到漆酶高表达转化子;通过q RT-PCR技术测得各转化子漆酶表达量,液体培养得到其粗酶液,采用分光光度法测其酶活以及在不同生理生化条件下的漆酶活性,为茶树菇的营养生理及遗传研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)构建了茶树菇的遗传转化体系:以茶树菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因(hph)作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因,应用PEG介导法构建了茶树菇遗传转化体系。结果表明,150μg/m L潮霉素可以完全抑制茶树菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3 h,原生质体得率最高。通过PEG介导将DNA片段转化入茶树菇原生质体后,获得的转化子经潮霉素筛选、PCR验证和荧光显微镜观察,证明外源基因hph和egfp已成功转入茶树菇中并获得稳定表达。(2)高效表达体系的建立:克隆actin、gpd和Pumgpd不同长度5个启动子片段,替换原有的启动子,对靶标基因的表达量进行分析。依据actin基因启动子构建的载体p Aa-actin-1和p Aa-actin-2获得转化子中,靶标基因表达量为对照3倍以上转化子数量分别为50%和33.33%,最高表达量分别为对照的10.45和6.23倍;携带p Aa-gpd-1、p Aa-gpd-2和p Aa-Pumgpd启动子的载体获得的转化子中,表达量为对照3倍以上的数量分别为0、28.57%和25%,最高表达量分别为对照的2.93、7.75和4.31倍。actin启动子获得高表达转化子得率较gpd和Pumgpd启动子片段高,适用于茶树菇转化体系构建。(3)YSG菌株漆酶基因家族的序列特征及过量表达转化子的酶活性分析:通过基因组注释信息及序列分析,共得到9个漆酶基因。克隆全长后连接到高效表达载体。通过q RT-PCR测定各漆酶转化子的表达量后,分别挑选高效表达转化子,以2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(简称ABTS)、愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚为底物,比较9种漆酶过量表达菌株漆酶活性,以Cu、K、Na、Mn、Ca、Fe、Fe、Mg、Zn为底物,研究9种金属离子对漆酶活性的影响,以2.8、3.3、3.8、4.3、4.8、5.3、5.8不同p H环境探究p H对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响,探究不同浓度漆酶酶活抑制剂EDTA对茶树菇9种漆酶过表达转化子漆酶活性的影响。结果发现,茶树菇内漆酶可能为酸性蛋白酶类,酶促反应的最适底物是ABTS;Cu对漆酶酶活有着促进作用,除K、Zn、Na对个别漆酶基因酶活有着促进作用外,其他金属离子对漆酶酶活均为抑制作用,探讨了不同底物与不同金属离子对漆酶催化反应的影响。(4)漆酶基因家族基因过量表达菌株对基质和生长发育的影响:与野生菌株YSG相比,漆酶基因过表达转化子出菇较早。