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Pseudomonas sp. W10溶藻机理及其溶藻活性成分特性解析研究

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Pseudomonas sp. W10溶藻机理及其溶藻活性成分特性解析研究

作者：王美娟常州大学

学位级别：硕士

铜绿微囊藻是有害藻华中具有代表性的种群,如果铜绿微囊藻在自然水体中泛滥,后果不仅是恶化水质对人类、水生生物的生命安全产生直接威胁,还会影响养殖业、旅游业等对经济发展造成间接损害。本课题选取太湖流域内野生田螺内脏中筛选出的... 详细信息

铜绿微囊藻是有害藻华中具有代表性的种群,如果铜绿微囊藻在自然水体中泛滥,后果不仅是恶化水质对人类、水生生物的生命安全产生直接威胁,还会影响养殖业、旅游业等对经济发展造成间接损害。本课题选取太湖流域内野生田螺内脏中筛选出的Pseudomonas sp.W10作为研究对象,其溶藻特性、溶藻动力学、损伤效应、溶藻产物与溶藻活性成分等都是揭示溶藻机理、调控藻细胞生物量的关键要素,通过分子生物学鉴定技术、生理生化学、光谱学技术以及气质联用等详细分析了上述溶藻要素。取得的主要研究成果如下:(1)在溶藻特性、溶藻动力学方面:细菌W10是一株释放胞外物质溶解、裂解铜绿微囊藻的假单胞菌(Pseudomonas sp.)。NA和淀粉培养基对W10菌株的培养效果无显著差异(P>0.05),二者显著优于改良基础培养基(P0.05),二者溶藻效果均表现为稳定期与衰亡期最好,然后依次是对数期和延滞期。W10菌液的最佳投加量为10%,溶藻率最高为80.05%,而无菌上清液的溶藻效果随着投加量的增加而提高,在1:2处理组溶藻率最高为92.15%。菌株W10的生长、溶藻过程分别遵循Logistic方程与一级反应动力学,拟合效果较好,对应R为0.9908、0.9882。(2)在藻细胞损伤效应方面:一方面,藻细胞生理生化情况发生紊乱,体现在指标含量大幅度减少。随着溶藻时间的延长,细胞呈现出负增长的情况,下降幅度最大为156.87%;细胞膜结构出现漏洞且无法再生修复,并伴有正常细胞2.73倍的核苷泄漏量;藻胆素浓度与净光合放氧速率下降明显,到培养结束藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白分别为1.43×10mg·L、4.36×10mg·L以及1.07×10mg·L,净光合放氧速率仅有17.54μmol O·(mg·Chla·h),光合作用受阻。另一方面,抗氧化系统指标均呈现出先增加后减少的趋势,无菌上请液胁迫下铜绿微囊藻会分泌较多的SOD、CAT保护藻细胞,MDA也因胁迫加剧而增多,但当越来越多细胞在逆境中解体死亡,SOD、CAT与MDA也随之减少。(3)在溶藻产物、溶藻路径方面:铜绿微囊藻溶藻产物组成复杂,以多种氨基酸、蛋白质、糖类、类腐殖酸以及含有芳香结构的化合物为主。紫外光谱测定不同时期的溶藻产物的URI值分别为1.20、1.19、1.18,URI指标变化说明芳香化程度逐渐升高。红外图谱解析发现,溶藻进程中溶藻产物存在7个明显的特征峰,涉及的官能团包括-OH、N-H、C-H、C=O、C=C等,根据半定量分析各组分的变化情况为大分子物质减少,如蛋白质、核酸、纤维素含量下降,而脂肪酸、糖类、脂肪族烷烃等小分子物质增多。三维荧光图谱识别出溶藻产物含有3个荧光峰,溶藻进程中氨基酸组分因蛋白质被分解含量增多,而腐殖质组分难以被降解残留于溶藻产物中,腐殖度升高。结合溶藻进程的微观图像,推测溶藻菌株W10可能的溶藻路径为:W10分泌溶藻活性物质→溶藻活性物质侵袭藻细胞→藻细胞结构出现漏洞→藻细胞质空化、胞内物质外溢→藻细胞正常生理功能丧失→藻细胞下沉溶解、死亡。(4)在溶藻活性成分方面;分离所得的溶藻活性物质能较好的溶于无水乙醇中,但溶藻率为61.32%的乙醇溶解相与无菌浓缩液的溶藻效果仍存在显著性差异(P溶藻活性物质是核酸、蛋白质、多糖等;4种极性不大的CCl、CHCl、CHCOOCH、石油醚萃取剂有机相溶藻效果较弱,溶藻率均小于52%,表明起主要作用的溶藻活性成分是强极性物质。不同规格透析样液溶藻效果不同,溶藻作用的强弱依次为:1.0k D>>3.5 k D>7.0 k D,由此溶藻活性成分相对分子量≤1.0 k D。GC-MS结果显示溶藻活性物质可能为酯类、烷烃类、醇类、芳香烃类或含氮化合物。

关键词：溶藻细菌溶藻机理损伤效应溶藻活性成分

细菌F5-2溶藻机理的初步探索及溶藻物质的初步鉴定

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细菌F5-2溶藻机理的初步探索及溶藻物质的初步鉴定

作者：田小方华中师范大学

学位级别：硕士

由于有害藻华(Harmful algal blooms)对经济和公共健康造成越来越严重的影响,人们已经展开了广泛的研究来进行控制。物理与化学技术在使用过程中都存在一定的局限性,所以生物控藻技术越来越受到人们的广泛关注。本实验室分离到一株细菌... 详细信息

由于有害藻华(Harmful algal blooms)对经济和公共健康造成越来越严重的影响,人们已经展开了广泛的研究来进行控制。物理与化学技术在使用过程中都存在一定的局限性,所以生物控藻技术越来越受到人们的广泛关注。本实验室分离到一株细菌F5-2,其菌液上清对赤潮藻异弯藻(Heterosigma akashiwo)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、金藻(Chrysophyta)、锥状克里斯普藻(Scrippsiella trochoidea)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)有显著的溶藻活性,对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)的生长有一定的抑制作用;对水华藻铜绿微囊藻(Microcysis aeruginosa)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)有显著的溶藻活性,能观察到沉淀黄化死亡现象。此外,VC对M. aeruginosa的生长也有一定的抑制作用,可观察到有藻沉淀现象。于是初步探索了菌液上清和VC对M. aeruginosa的作用机理。菌液上清(v/v=1：50)和VC(w/v=1：5000)处理藻液,首先观察到处理过程中两者的现象有差别,菌液处理组中有明显的沉淀黄化死亡现象,而VC处理组中只有明显的沉淀现象;再通过对处理过程中全部藻细胞和悬浮藻细胞的计数,计算沉淀藻细胞数量的变化,发现菌液处理组中藻细胞沉淀死亡,进而减少,VC处理组中藻细胞沉淀后数量基本不变;对处理过程中藻细胞的电镜观察,发现随着处理时间的延长,菌液处理组中藻细胞很快破裂,数量大幅度减少,VC处理组中藻细胞的状态和数量基本变化不大;通过对处理过程中藻细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化的测定与比较,结果表明两个处理组还是有很大差别的,推断两者对M. aeruginosa的溶藻机理有很大差别,菌液上清对藻细胞的作用,可能与活性氧和自由基的积累有关,在沉淀过程中同时伴随着死亡,而VC的作用与之无关,只能使藻细胞沉淀,并不能溶杀藻细胞。其胞外产物对H. akashiwo有溶藻活性,为了探索溶藻活性物质的性质和结构,进行了稳定性、蛋白酶及核酸酶、透析、醇沉和萃取等试验,再通过HPLC和TLC结合,2种分离方法同时对其进行分离纯化,通过质谱、红外和元素分析等对其进行初步鉴定。结果表明,活性物质性质基本稳定,受温度和放置时间的影响较小;活性物质不是多糖、核酸和蛋白类;其分子量小于2KD;是弱极性的亲酯性物质;采用HPLC分离,通过分析参数的优化,确定了分离条件：EclipseXDB-C18柱,25℃,流速0.3mL/min,检测波长300nm,流动相为V(水)：V(甲醇)=60：40等度洗脱;采用TLC分离,确定了分离条件：展开剂V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1,比移率Rf约在0.8033-0.927,再次展开,展开剂V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=4：1,得到较纯的溶藻活性物质组分;最后经过一系列鉴定,确定溶藻活性物质分子量约是260Da,其结构中不含N、P、S和不饱和键,可能至少含有Ar-,-OH,-C=O和-CH2-,约有11个C,15个H。

关键词：沉淀溶藻机理酶溶藻活性物质初步鉴定

高效铜绿微囊藻溶藻菌WJ6的筛选及溶藻机理

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高效铜绿微囊藻溶藻菌WJ6的筛选及溶藻机理

作者：王佳安徽建筑大学

学位级别：硕士

人类将富含氮、磷等的城市生活污水和工业废水排放入水体,使水体的氮、磷营养过剩,促使其中的藻类过量生长,使淡水水体发生水华,海洋发生赤潮,造成水体富营养化。因此,治理蓝藻水华是解决水体富营养化的主要途径。治理蓝藻水华一般有物... 详细信息

人类将富含氮、磷等的城市生活污水和工业废水排放入水体,使水体的氮、磷营养过剩,促使其中的藻类过量生长,使淡水水体发生水华,海洋发生赤潮,造成水体富营养化。因此,治理蓝藻水华是解决水体富营养化的主要途径。治理蓝藻水华一般有物理、化学、生物方法,但由于前两者操作不易,耗资较大,易产生二次污染等问题,使生物方法治理蓝藻水华成为主要手段。目前,国内外研究者对生物方法中溶藻菌的溶藻作用研究越来越多,应用于实际中的实例也越来越普遍。本文以铜绿微囊藻为研究对象,从富营养化水体中分离出一株具有高效溶藻作用的溶藻菌WJ6,对其进行了形态观察、生理生化鉴定和16S rRNA序列分析,分别研究了溶藻菌的不同培养时期、不同浓度菌液及不同环境因子对溶藻效果的影响,分析溶藻菌的溶藻特性。并探究了该菌株对铜绿微囊藻的溶藻方式及其胞外活性物质的特性,在溶藻过程产生的溶藻产物进行了特性分析。研究结果如下:(1)从富营养化水体中分离出的溶藻菌WJ6呈革兰氏阴性,单菌落呈红色,菌落小,圆形,边缘规则,表面光滑且湿润。溶藻菌生理生化鉴定结果是:甲基红、过氧化氢、明胶液化试验为阳性;V-P试验为阴性;糖酵解试验为发酵型;利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖并还原硝酸盐。结合形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析,溶藻菌WJ6属于沙雷氏菌属,GenBank登录号为KY462187。(2)溶藻菌WJ6处于对数期时的溶藻效果最好,溶藻率达87.50%±2.41%;菌液浓度达1.4×10CFU/m L以上,溶藻率最高,为95.69%±1.00%;在30℃、pH8条件下,活性较强;30℃、pH8条件下溶藻率为分别为99.48%±0.21%、92.47%±4.02%;菌株WJ6对微囊藻生长的抑制效果是全黑条件>光循环条件>全光条件,全黑条件下溶藻率最高为97.06%±1.20%。用5种不同培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基、LB培养基、改良的基本培养基、BG11培养基、查氏培养基)培养溶藻菌,探究溶藻菌的溶藻效果,其中牛肉膏蛋白胨液体培养基培养的溶藻菌溶藻效果最好,溶藻率可达96.00%±1.87%;在培养基中分别加入不同浓度的NHCl和NaCl,可知当铵离子浓度大于2 mol/L时,在一定范围内,溶藻菌的溶藻率一样,为98.33%±1.67%,当盐度为0.5%时,溶藻率较高,为92.77%±2.95%。(3)溶藻菌WJ6对铜绿微囊藻的作用方式是间接溶藻。溶藻菌起溶藻作用的胞外分泌液中活性物质主要分子量>8 KD,并且活性物质是混合物质;胞外分泌液经乙醇沉淀后,沉淀部分的溶藻率大于上清液部分,为82.72%±1.75%;胞外分泌液经不同温度和酸碱度处理后,在25℃、pH8时,活性较强,溶藻率分别为92.97%±3.32%和94.69%±2.17%;胞外分泌液中活性物质具有较高的抗氧化性。(4)在不同浓度菌液对铜绿微囊藻进行溶藻过程中,对其溶藻产物进行了特性分析。在438 nm、619-628 nm、673-677 nm处分别出现了紫外吸收峰且不同浓度组的峰型相似,峰强随着菌液浓度的增加而增加;不同浓度菌液的溶藻产物的三维荧光特征峰很相似,但实验组的峰强高于对照组,稀释倍数越高,峰强越小,说明溶藻产物浓度越小。经红外光谱扫描后,可知溶藻产物中含有N-H、C-H、O=N-O-(-NO)、C-O等键;结合三维荧光扫描后,可知主要溶藻产物为类色氨酸物质。将溶藻产物荧光强度与菌液浓度作相关性分析,更进一步说明菌液浓度对溶藻效果的影响,即菌液浓度越大,溶藻菌的溶藻效果也越明显。

关键词：铜绿微囊藻蓝藻水华溶藻菌溶藻特性溶藻机理溶藻产物

一株广谱性溶藻细菌的筛选鉴定、溶藻特性及溶藻机理的研究

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一株广谱性溶藻细菌的筛选鉴定、溶藻特性及溶藻机理的研究

作者：张嗣萍西南大学

学位级别：硕士

水体富营养化及蓝藻水华的爆发是当今全球范围内的环境问题之一。我国的许多大中型浅水湖泊如太湖、巢湖、滇池等的蓝藻水华的爆发范围和强度都已经相当严重,造成水体生态系统结构和功能的紊乱,影响旅游、养殖等行业的健康发展。我国爆... 详细信息

水体富营养化及蓝藻水华的爆发是当今全球范围内的环境问题之一。我国的许多大中型浅水湖泊如太湖、巢湖、滇池等的蓝藻水华的爆发范围和强度都已经相当严重,造成水体生态系统结构和功能的紊乱,影响旅游、养殖等行业的健康发展。我国爆发的有害蓝藻水华以微囊藻水华为主,其出现频度最高,分布范围最广,持续时间最长,造成的危害最大。丝状蓝藻鱼腥藻水华出现频度和规模仅次于微囊藻水华,而鱼腥藻的形态、生理生态和有害产物(如毒素和异味物质)具有更高的多样性。由于其潜在的产毒性和向中纬度地区的侵略性,另一种丝状水华蓝藻拟柱孢藻也获得了广泛关注。微生物控藻技术具有低成本、环境友好、无二次污染等优点,成为相关领域的研究热点。本文以铜绿微囊藻、真紧密鱼腥藻、拉氏拟柱孢藻为控藻对象,从武汉市新洲区土壤中筛选溶藻细菌,分析溶藻菌的生理生化特征及其系统发育特征,对菌株进行鉴定,进一步研究该菌株对铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7806、真紧密鱼腥藻Anabaena eucompacta CHAB 1799、拉氏拟柱孢藻Cylindrospermopsis raciborskii CHAB 151的溶藻特性、溶藻方式、溶藻活性物质的性质,并考察了温度、光照强度等环境因子对溶藻效果的影响,并将该菌株作用于产拟柱孢藻毒素(Cylindrospermopsin,CYN)的*** CHAB 3438,研究该菌株的溶藻机理和对毒素浓度及分布的影响。主要研究结果如下所述:1、本文从武汉市新洲区的土壤中分离筛选到一株对PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151均有较强溶藻作用的菌株Lysinibacillus ***,该菌株呈棒杆状,长约1.3.7μm,宽约0.45.55μm,芽孢端生,球形,膨大,革兰氏染色阳性,多以单个细胞的形式出现。2、同一种溶藻菌对不同水华蓝藻的溶藻菌阈值大小不一,菌株WP抑制PCC7806生长的细胞密度阈值小于或等于6×10 cfu/mL,CHAB 1799和CHAB 151分别为6×10、6×10 cfu/mL。藻的生理状态和藻细胞密度是影响溶藻效果的重要因素,而菌株WP的生理状态几乎不会影响其溶藻能力。菌株WP对多种水华蓝藻均有较强的溶藻效果,对不同种类、同种不同株系的水华蓝藻溶藻效率高低不等,对绿藻没有明显的溶藻效果。该菌株对PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151的溶藻方式均为间接溶藻。该菌株分泌的溶藻活性物质的热稳定性、酸碱稳定性均较高,该物质可能是相对分子质量小于3 KDa的非蛋白类物质。当温度为155℃时,该菌株对PCC 7806和CHAB 151这两种蓝藻均有较高的溶藻效率。当光照强度范围为100μmol·m·s时,对PCC 7806、CHAB 1799和CHAB 151这三种蓝藻均有较强的溶藻作用。3、PCC 7806的最适生长温度为35℃,CHAB 151的最适生长温度范围为255℃。PCC 7806、CHAB 1799在光照强度为30μmol·m·s时生长最好,CHAB 151最适光照强度范围为300μmol·m·s。相较CHAB 1799、CHAB 151,PCC 7806能够适应范围更广的光照强度和温度。4、菌株WP通过分泌活性物质作用CHAB 3438,该物质破坏藻细胞的气囊,使藻丝沉底,同时破坏光合作用色素,首先破坏的是别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC),其次是叶绿素a(Chlorophyll a,Chl-a),藻细胞的F/F值显著降低,光合效率降低,藻类不能正常进行光合作用而逐渐死亡。随着作用时间的延长,藻细胞逐渐破裂,内含颗粒物释放到胞外环境中,胞内毒素也释放到胞外,然而该活性物质不能降解CYN,导致胞外毒素占比升高,但从根本上控制了CYN的绝对总量。本文关注新型丝状水华蓝藻真紧密鱼腥藻和产毒拉氏拟柱孢藻,筛选到一株广谱性的溶藻细菌,丰富了此类水华蓝藻溶藻细菌资源库。该菌株通过分泌溶藻活性物质破坏拟柱孢藻气囊,控制了CYN的绝对总量,但同时造成了胞外CYN占比增大。本文为溶藻菌控藻提供了溶藻新思路,但同时应注意溶藻过程中藻毒素释放的问题,此类细菌在实际应用过程中,可与CYN等毒素降解菌联用或增加去除藻毒素的后续措施。

关键词：溶藻细菌水华蓝藻溶藻特性溶藻机理拟柱孢藻毒素

高效溶藻菌的分离鉴定、溶藻特性及溶藻机理研究

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高效溶藻菌的分离鉴定、溶藻特性及溶藻机理研究

作者：邵思城西安建筑科技大学

学位级别：硕士

本研究从西安某富营养化水体和底泥中分离、纯化获得具有高效溶藻(铜绿微囊藻)特性的两株细菌,试验研究了溶藻细菌的生理生化特性、溶藻特性、溶藻方式、溶藻产物特性、溶藻细菌生物脱氮与微囊藻毒素降解特性以及原水水体除藻与脱氮性能... 详细信息

本研究从西安某富营养化水体和底泥中分离、纯化获得具有高效溶藻(铜绿微囊藻)特性的两株细菌,试验研究了溶藻细菌的生理生化特性、溶藻特性、溶藻方式、溶藻产物特性、溶藻细菌生物脱氮与微囊藻毒素降解特性以及原水水体除藻与脱氮性能,结果表明:1.分离的两株高效溶藻细菌被命名为R11和J25,结合形态特征、生理生化特性及16S r RNA序列分析,分别被鉴定为拉乌尔菌属(Raoultella)和不动杆菌属(Acinetobacter)。当溶藻细菌R11和J25接菌量(v/v)为10%,15%,20%,25%和30%,8天后菌株R11对叶绿素a的去除率分别为40.00%,40.82%,90.38%,90.70%和94.00%,菌株J25对叶绿素a的去除率分别为36.67%,44.50%,86.54%,90.70%和96.00%。当铜绿微囊藻密度OD为0.615,0.517,0.417,0.301,0.220,0.120,6天后菌株R11对叶绿素a的去除率依次为90.36%,81.97%,84.21%,86.67%,93.55%,95.24%,菌株J25对叶绿素a的去除率依次为80.72%,81.97%,85.97%,86.67%,87.10%,90.48%。在全光照和全黑暗条件下,菌株R11对叶绿素a有很好的去除效果,而菌株J25在全黑暗条件下效果不显著。更换BG11中含量成分,溶藻细菌R11和J25接菌量(v/v)大于10%时,叶绿素a去除率均在80%以上。2.溶藻细菌R11可以还原NO-N:在36h内,使溶液中硝酸盐浓度从5.59mg/L减少到0mg/L,NO-N被完全去除,反硝化速率为0.155mg·L·h。溶藻细菌R11和J25能够利用铜绿微囊藻作为碳源和氮源进行生物脱氮。在纯藻粉作为碳源和氮源的实验中,接菌量为10%(v/v),从第0天到第4天,与空白组比较,溶藻细菌R11对硝酸盐和氨氮的最大去除率分别为70.77%和65.71%,而溶藻细菌J25对硝酸盐和氨氮的最大去除率为69.15%和20.21%。3.溶藻细菌R11和J25释放的溶藻活性物质主要存在于胞外物质中,推断溶藻方式为间接溶藻。扫描铜绿微囊藻在波长400nm-800nm之间的最大吸收波长为680nm,并研究藻细胞个数与OD之间的相关性。菌株R11按照10%、15%、20%、25%和30%的接菌量(v/v)投加到铜绿微囊藻中,8d后,溶液中SOD含量分别变为对照组的1.78倍、1.91倍、2.23倍、2.30倍和2.95倍。菌株J25在藻液中SOD酶活性所呈现的趋势特征与菌株R11一致。同时用扫描电镜观察了不同时段内铜绿微囊藻细胞被溶藻细菌R11(接菌量为25%,v/v)破坏的形态变化。4.分析傅里叶变换红外光谱、三维荧光光谱的特点,研究溶藻细菌R11释放的溶藻产物成分及特征。6d后,EEM光谱上出现5个峰,在Ex/Em=280/315、230/310、240/430处分别代表溶解性代谢产物、蛋白质及富里酸,在Ex/Em=415/380和355/430处均代表腐殖酸。溶藻细菌R11和J25的培养液用酸和碱前后处理过后,当其接菌量(v/v)超过20%时,4天内叶绿素a去除率达到80%以上,说明溶藻细菌R11和J25的溶藻产物能够耐酸碱性。5.在溶藻和生物脱氮的试验中,溶藻细菌R11接菌量为20%(v/v)时,在6天内,叶绿素a和硝酸盐的最大去除率分别为73.12%和84.03%,此时脱氮效率为1.57mg NO-N·L·h。当溶藻细菌R11投加量(v/v)依次为10%,15%,20%,25%,30%时,经过6d后,叶绿素a的去除率分别为38.52%,57.63%,71.64%,85.13%,93.58%,同时铜绿微囊藻表面的Zeta电位的绝对值差值逐渐增加。6.当溶藻细菌R11接菌量(v/v)为28.20%、藻密度(OD)为0.31、温度为31.40℃,叶绿素a的最大去除率为77.81%。固定化细菌J25的溶藻效率比R11高,当固定化溶藻细菌J25投加量超过30个,8d后,叶绿素a的去除效率达到80%以上。溶藻细菌R11和J25复配(30%,v/v)后,初始藻密度(以OD表示)分别为0.504,0.401,0.300,0.201,0.102时,4d后,叶绿素a的去除效率分别为92.68%,92.17%,96.00%,96.29%,97.01%。当溶藻细菌R11投加到富营养化原水中:24d后,原水中叶绿素的去除率为74.59%,硝酸盐的去除率为99.74%。而溶藻菌株J25对原水中叶绿素和硝酸盐的去除率分别为87.76%和100%。运用高通量测序仪,研究了富营养化原水中微生物的群落结构特征。

关键词：溶藻细菌铜绿微囊藻溶藻产物溶藻机理生物脱氮高通量测序

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铜绿微囊藻溶藻菌的筛选及其溶藻机理研究

铜绿微囊藻溶藻菌的筛选及其溶藻机理研究

作者：朱赢江汉大学

学位级别：硕士

由于全球气候变暖和水体富营养化加剧,蓝藻水华在全世界范围内频繁暴发,破坏水体环境,影响水生态平衡。当蓝藻水华暴发时,往往伴随着藻毒素的释放,降低生物多样性,严重危害人类的健康和生存,同时降低了水资源的利用价值,阻碍了经济的发... 详细信息

由于全球气候变暖和水体富营养化加剧,蓝藻水华在全世界范围内频繁暴发,破坏水体环境,影响水生态平衡。当蓝藻水华暴发时,往往伴随着藻毒素的释放,降低生物多样性,严重危害人类的健康和生存,同时降低了水资源的利用价值,阻碍了经济的发展。微囊藻水华是水华蓝藻中最为常见的种属,其暴发频率高,持续时间长,分布范围广,造成的影响大,因此探寻高效、环境友好的除藻方法仍是近年来的研究热点与难点。微生物除藻技术以成本低、高效、无二次污染的特点而备受研究者的关注,是控制蓝藻水华技术发展的趋势所在。细菌是水生态系统中的重要组成部分,溶藻菌作为新型除藻剂为研究除藻技术提供了新思路。本研究以蓝藻水华中的优势种—铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为溶藻对象,从太湖腐殖质中分离筛选溶藻菌并探究其溶藻特性和溶藻机制,从而为藻华治理提供菌种资源和理论支持。主要研究结果如下:1.从太湖腐殖质中分离筛选出1株能够有效溶解铜绿微囊藻FACHB-905的溶藻菌S4,其菌落呈乳白色、表面粗糙、边缘不规则,为革兰氏阳性菌。通过16S r RNA序列构建系统发育树分析鉴定,菌株S4属于芽孢杆菌(Bacillus),在中国微生物科学数据中心的获得的编号为NMDCN00017DJ。2.溶藻菌S4对铜绿微囊藻的溶藻方式为间接溶藻;铜绿微囊藻与菌株S4的原菌液、胞外分泌液、菌悬液、超声破碎液共培养7天后,胞外分泌液处理组的溶藻效果最佳,叶绿素a降至0.08±0.05 mg/L,溶藻率为94.41±4.2%;在菌株S4的各个生长阶段中,对数生长期的溶藻菌S4溶藻效果最强,7天后叶绿素a含量为0.16±0.12 mg/L,显著低于停滞期和稳定期(P溶藻率为91.33±3.44%,与原菌液的溶藻率相比仅低1.33%;在不同的温度处理下,相较于20℃和25℃,培养温度为30℃时,溶藻效果最佳,溶藻率为94.74±3.93%;光周期的改变对溶藻菌S4的溶藻效果无明显的影响,菌液S4在有光照条件下(12h:12h光暗循环、全光照)和无光照(全暗)条件下,实验期间内叶绿素a含量不存在显著性差异,菌株S4产生的溶藻物质对铜绿微囊藻的溶藻作用不具有光依赖性;当藻液初始叶绿素a浓度低于1.46 mg/L时,菌液S4在4天内可达到80%以上的溶藻率。3.在溶藻菌S4胞外分泌液的作用下,藻细胞受到了氧化损伤,细胞膜完整性被严重损害。藻细胞内丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)活性随着培养时间的持续而增加,7天后MDA含量为3.71±0.62μmol/mg pro,CAT含量为80.75±8.51 U/mg pro;超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性呈现前期升高后期下降的趋势,SOD活性为在第4天达到最高值138.24±5.6 U/mg pro,POD活性的最高值为118.71±22.9 U/mg pro。溶藻菌S4分泌的胞外物质对藻细胞产生了氧化胁迫,并随着培养时间的延长使藻细胞膜氧化损伤程度不断加深,引起酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统的响应。4.在溶藻菌S4作用下,藻细胞进行光合作用的基因psa B表达量24h下调0.45倍,参与合成藻毒素的基因mcy B、mcy D、mcy A,在72 h后,相对表达量均显著下调(P藻细胞进行光合作用,影响藻细胞的正常生长代谢,并有效抑制微囊藻毒素合成基因的表达。

关键词：蓝藻水华铜绿微囊藻溶藻菌抗氧化系统溶藻机理

一株太湖流域土著溶藻菌的分离鉴定、溶藻特性及溶藻机理研究

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一株太湖流域土著溶藻菌的分离鉴定、溶藻特性及溶藻机理研究

作者：张冬慧北京交通大学

学位级别：硕士

水体富营养化引起的藻类水华在世界范围内频发,对水生态环境造成严重破坏。寻找行之有效的控藻措施已迫在眉睫。近年来,基于菌藻互作的生态修复技术因其低成本,生态相容性好等特点而备受关注,具有广泛的应用前景。溶藻菌(algicidal bact... 详细信息

水体富营养化引起的藻类水华在世界范围内频发,对水生态环境造成严重破坏。寻找行之有效的控藻措施已迫在眉睫。近年来,基于菌藻互作的生态修复技术因其低成本,生态相容性好等特点而备受关注,具有广泛的应用前景。溶藻菌(algicidal bacteria)是指以直接或间接方式抑制藻类生长,或杀死藻类、溶解藻细胞的一类细菌的统称。溶藻菌在水生态系统中能有效调节生物种群结构,在维持微藻的生物量平衡方面扮演着重要的角色。而土著溶藻菌对当地环境及营养条件适应力强,无菌种退化之虞,与外源溶藻菌相比不存在生物入侵的问题,因此从藻华爆发水域筛选土著溶藻菌成为溶藻菌领域的研究热点。本文基于此,以太湖流域水华优势藻种铜绿微囊藻为供试藻,从太湖流域宛山荡分离具有高效溶藻效果的土著溶藻菌,并对该菌开展了溶藻特性研究、溶藻机理研究,最后通过响应曲面法对该株具有应用潜力的溶藻菌的发酵培养基及培养条件进行了优化,获得以下结论:1、从太湖流域宛山荡微囊藻水华爆发地分离出一株具有高效、稳定溶藻效果的革兰氏阳性菌,编号为WS8,其菌落为淡黄色,圆形,边缘规则,表面光滑且湿润。菌株WS8的V-P试验及明胶液化试验均为阴性,过氧化氢及甲基红试验为阳性,能够还原硝酸盐。菌株WS8经16SrDNA分子鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),与Bacillus amyloliquefaciens(GenBank登录号为KC441776)的16S rDNA序列相似度为99%。2、溶藻菌WS8对铜绿微囊藻有着明显的抑制效果。在溶藻菌WS8的各个生长时期中,以稳定期菌液溶藻效果最强,4天溶藻率高达91.7%;菌液溶藻效果随投加比例的增加而增强,但投加量5%与投加量10%的处理组溶藻效果无显著性差异,4天溶藻率分别为91.3%及93.3%;菌液对高浓度水华藻的抑制作用较迟滞,对低浓度水华藻的抑制作用迅速,但4天溶藻率并无显著性差异,分别为91.5%和96.4%;溶藻菌WS8对温度及pH适应能力较强,在温度为30℃,pH为8时溶藻率最高,分别为98.1%和90.8%,具有较好的工程应用价值。3、溶藻菌WS8通过分泌具有溶藻特性的胞外活性物质间接溶藻。该活性物质使藻细胞周期被阻滞到DNA复制前期,从而导致藻细胞不能正常进行DNA复制及分裂;该活性物质对藻细胞产生氧化损伤,破坏藻细胞抗氧化酶系统;该活性物质还能降低藻细胞光合电子传递效率,进而影响其正常的光合作用,从而降低藻细胞生物量。4、为将该株溶藻菌制备成高效生物除藻剂,需提高溶藻菌WS8的菌浓度。故在实验室的条件下,通过摇瓶实验采用响应面优化法对溶藻菌WS8的培养参数进行了优化,得到溶藻菌WS8的最佳培养基及培养参数为:麸皮24.00 g/L、豆粕10.10g/L、NaCl 1.00 g/L、KH2P04 0.20 g/L、MgS04 0.20 g/L、MnS04 0.03 g/L、pH7.00、温度28.96℃、摇床转速150.00 r/min、装瓶比40%、接种比1%。经验证,溶藻菌WS8的浓度达到1.11×109CFU/mL,相比于牛肉膏蛋白胨培养基,菌浓度得到了大幅度提高,可用于指导溶藻菌WS8工程菌剂的制备和生产。综上所述,本研究筛出的太湖流域土著溶藻菌具备开发成生物控藻剂的潜力,可为当地蓝藻水华控制工作提供技术备选。

关键词：太湖流域溶藻菌铜绿微囊藻溶藻机理响应曲面法

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一株铜绿微囊藻溶藻菌的溶藻机理研究

安徽建筑大学学报 2017年第4期25卷 19-23页

作者：王佳洪桂云张瑾安徽建筑大学环境与能源工程学院安徽合肥230601

以铜绿微囊藻为溶解对象,从巢湖中分离到1株溶藻菌H2。探讨了菌株H2对铜绿微囊藻的溶藻方式,菌株H2胞外活性物质的溶藻特性。结果表明,菌株H2是间接溶藻。溶藻菌起溶藻作用的胞外分泌液中活性物质主要为分子量小于3.5k D的物质,并且活... 详细信息

以铜绿微囊藻为溶解对象,从巢湖中分离到1株溶藻菌H2。探讨了菌株H2对铜绿微囊藻的溶藻方式,菌株H2胞外活性物质的溶藻特性。结果表明,菌株H2是间接溶藻。溶藻菌起溶藻作用的胞外分泌液中活性物质主要为分子量小于3.5k D的物质,并且活性物质是混合物质;菌株胞外分泌液经乙醇沉淀后,上清液部分的溶藻率大于沉淀部分,为52.50%;胞外分泌液经不同温度和酸碱度处理后,在25℃、p H=12.0时,活性较强,溶藻率分别为98.0%和97.1%;胞外分泌液中活性物质具有一定的抗氧化性。

关键词：溶藻菌铜绿微囊藻胞外活性物质溶藻机理

芽孢杆菌dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶藻机理研究

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生物技术通讯 2017年第4期28卷 485-489页

作者：司晓光张晓青郝建安姜天翔杜瑾杨波张爱君王静国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所天津300192

目的:本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021,研究其对链状亚历山大藻的抑制效果,及其溶藻作用方式。方法:在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等,间隔一定时间计数获得藻细胞的数... 详细信息

目的:本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021,研究其对链状亚历山大藻的抑制效果,及其溶藻作用方式。方法:在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等,间隔一定时间计数获得藻细胞的数量。结果:菌株dhs-330-021培养后期的发酵液溶藻效果好于培养前期和中期;在一定浓度范围内,dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻均有溶藻效果,其中对延滞期和稳定期效果最好;菌株的发酵液和无菌上清液的溶藻效果明显,而菌悬液溶藻效果较差。结论:菌株dhs-330-021能显著抑制链状亚历山大藻的生长,其溶藻方式属于间接溶藻。

关键词：链状亚历山大藻芽孢杆菌溶藻机理表面活性剂