细菌F5-2溶藻机理的初步探索及溶藻物质的初步鉴定

作     者：田小方 

作者单位：华中师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵以军;程凯

授予年度：2012年

学科分类：07[理学] 08[工学] 09[农学] 0815[工学-水利工程] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：沉淀 溶藻机理 酶 溶藻活性物质 初步鉴定 

摘      要：由于有害藻华(Harmful algal blooms)对经济和公共健康造成越来越严重的影响,人们已经展开了广泛的研究来进行控制。物理与化学技术在使用过程中都存在一定的局限性,所以生物控藻技术越来越受到人们的广泛关注。 本实验室分离到一株细菌F5-2,其菌液上清对赤潮藻异弯藻(Heterosigma akashiwo)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、金藻(Chrysophyta)、锥状克里斯普藻(Scrippsiella trochoidea)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)有显著的溶藻活性,对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)的生长有一定的抑制作用;对水华藻铜绿微囊藻(Microcysis aeruginosa)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)有显著的溶藻活性,能观察到沉淀黄化死亡现象。 此外,VC对M. aeruginosa的生长也有一定的抑制作用,可观察到有藻沉淀现象。于是初步探索了菌液上清和VC对M. aeruginosa的作用机理。菌液上清(v/v=1：50)和VC(w/v=1：5000)处理藻液,首先观察到处理过程中两者的现象有差别,菌液处理组中有明显的沉淀黄化死亡现象,而VC处理组中只有明显的沉淀现象;再通过对处理过程中全部藻细胞和悬浮藻细胞的计数,计算沉淀藻细胞数量的变化,发现菌液处理组中藻细胞沉淀死亡,进而减少,VC处理组中藻细胞沉淀后数量基本不变;对处理过程中藻细胞的电镜观察,发现随着处理时间的延长,菌液处理组中藻细胞很快破裂,数量大幅度减少,VC处理组中藻细胞的状态和数量基本变化不大;通过对处理过程中藻细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化的测定与比较,结果表明两个处理组还是有很大差别的,推断两者对M. aeruginosa的溶藻机理有很大差别,菌液上清对藻细胞的作用,可能与活性氧和自由基的积累有关,在沉淀过程中同时伴随着死亡,而VC的作用与之无关,只能使藻细胞沉淀,并不能溶杀藻细胞。 其胞外产物对H. akashiwo有溶藻活性,为了探索溶藻活性物质的性质和结构,进行了稳定性、蛋白酶及核酸酶、透析、醇沉和萃取等试验,再通过HPLC和TLC结合,2种分离方法同时对其进行分离纯化,通过质谱、红外和元素分析等对其进行初步鉴定。结果表明,活性物质性质基本稳定,受温度和放置时间的影响较小;活性物质不是多糖、核酸和蛋白类;其分子量小于2KD;是弱极性的亲酯性物质;采用HPLC分离,通过分析参数的优化,确定了分离条件：EclipseXDB-C18柱,25℃,流速0.3mL/min,检测波长300nm,流动相为V(水)：V(甲醇)=60：40等度洗脱;采用TLC分离,确定了分离条件：展开剂V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1,比移率Rf约在0.8033-0.927,再次展开,展开剂V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=4：1,得到较纯的溶藻活性物质组分;最后经过一系列鉴定,确定溶藻活性物质分子量约是260Da,其结构中不含N、P、S和不饱和键,可能至少含有Ar-,-OH,-C=O和-CH2-,约有11个C,15个H。