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小脑浦肯野细胞复杂尖峰响应机制研究

小脑浦肯野细胞复杂尖峰响应机制研究

作者：刘毅奔西安电子科技大学

学位级别：硕士

随着脑和神经系统研究的深入发展,小脑学习与记忆的神经机制逐渐被人们所了解。最新研究表明,浦肯野细胞是小脑皮质的唯一输出神经元,它在感觉感知、运动控制中扮演重要角色。然而目前关于浦肯野细胞在小脑信息处理中的作用尚不完全清... 详细信息

随着脑和神经系统研究的深入发展,小脑学习与记忆的神经机制逐渐被人们所了解。最新研究表明,浦肯野细胞是小脑皮质的唯一输出神经元,它在感觉感知、运动控制中扮演重要角色。然而目前关于浦肯野细胞在小脑信息处理中的作用尚不完全清楚。因此,本文开展小脑浦肯野细胞复杂尖峰响应机制研究,主要内容包括:(1)首先论文在现有浦肯野细胞生理实验数据的基础上,结合多种细胞复杂尖峰响应波形,提出一种复杂尖峰识别提取方法。此外,通过在浦肯野细胞上施加不同参数的攀缘纤维突触刺激,研究分析复杂尖峰响应机制。实验结果表明,攀缘纤维突触的数量、分布区域以及最大电导对复杂尖峰响应的持续时间和小穗峰值、数量均有重要作用。(2)为更好地探索浦肯野细胞复杂尖峰响应机制,本文进一步研究复杂尖峰响应与不同离子电流的关联性。首先,利用离子通道在浦肯野细胞上的分布特点,分析几种主要离子电流与复杂尖峰的相关性;然后,研究细胞电压如何调制复杂尖峰的持续时间和响应后暂停;最后,在细胞输出简单尖峰的基础上结合复杂尖峰的瞬时爆发特性分析复杂尖峰对简单尖峰的调制作用。实验结果表明,复杂尖峰受到不同离子电流的促进或抑制作用,而复杂尖峰后暂停时长与细胞极化状态正相关。当复杂尖峰小穗数目与持续时间增加后,简单尖峰的发放频率短时间内被抑制。综上所述,本文聚焦研究小脑浦肯野细胞复杂尖峰响应机制,提出了一种复杂尖峰识别提取方法,并通过攀缘纤维突触与离子通道对浦肯野细胞的实验分析较好地揭示了浦肯野细胞的电响应原理。

关键词：浦肯野细胞攀缘纤维复杂尖峰简单尖峰

脑立体定位斜插法在小脑蚓部第Ⅸ小叶浦肯野细胞纤维投射研究中的应用

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成都医学院学报 2024年

作者：龚劲雯杨倩颖戴婷李淑蓉伍丽娜苏炳银赵海霞成都医学院体温与炎症四川省高校重点实验室成都医学院组织学与胚胎学教研室成都医学院发育与再生四川省重点实验室成都医学院病理学与病理生理学教研室

目的探讨脑立体定位斜插法靶向注射小鼠小脑蚓部第Ⅸ小叶的可行性，并观察该方法对小鼠小脑蚓部第Ⅸ小叶浦肯野细胞纤维的神经投射。方法利用脑立体定位直插法（进针方向与水平方向垂直）或斜插法（进针方向与水平方向的垂直线呈30°... 详细信息

目的探讨脑立体定位斜插法靶向注射小鼠小脑蚓部第Ⅸ小叶的可行性，并观察该方法对小鼠小脑蚓部第Ⅸ小叶浦肯野细胞纤维的神经投射。方法利用脑立体定位直插法（进针方向与水平方向垂直）或斜插法（进针方向与水平方向的垂直线呈30°夹角）标记小脑蚓第Ⅸ小叶，对比两种手术方式对小鼠颈部上方肌肉组织的影响；选择梯度剂量（500nL、300nL、150nL）的顺行示踪病毒，探索最适宜的病毒注射剂量；通过斜插法在Pcp2-Cre小鼠小脑蚓第Ⅸ小叶注射重组酶依赖性顺行示踪病毒，观察该小叶浦肯野细胞的传出神经投射。结果相较于脑立体定位直插法，斜插法中小鼠头部皮肤切口更小，且几乎不破坏小鼠颈部上方肌肉；在前囟后6.00mm，中线旁开0.00mm，深4.08mm坐标处，采用斜插法能够靶向定位到小脑蚓第Ⅸ小叶；经分析发现，150nL低剂量的病毒可较好的标记小脑蚓第Ⅸ小叶浦肯野细胞，且不发生泄漏；通过病毒顺行示踪，在Pcp2-Cre小鼠小脑顶核中间部、前庭小脑核、前庭内侧核巨细胞部以及前庭下核均检测到来自第Ⅸ小叶浦肯野细胞的神经投射纤维。结论脑立体定位斜插法能在一定程度上减轻手术对小鼠颈部上方肌肉的破坏，通过该方法注射顺行示踪病毒能精确靶向小脑后叶蚓部第Ⅸ小叶，并观察到该小叶浦肯野细胞的传出神经投射。

关键词：小脑后叶蚓部第Ⅸ小叶浦肯野细胞脑立体定位技术病毒顺行示踪

小脑浦肯野细胞特异性敲除Snx14导致小脑共济失调相关机制的研究

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小脑浦肯野细胞特异性敲除Snx14导致小脑共济失调相关机制的研究

作者：杨伟杰厦门大学

学位级别：硕士

常染色体隐性遗传小脑性共济失调（Autosomal-recessive cerebellar ataxias,ARCAs）是一类遗传性神经退行性疾病,表现为肢体运动的自主协调能力受损。其中常染色体隐性脊髓小脑共济失调症20（Autosomal recessive spinocerebellar atax... 详细信息

常染色体隐性遗传小脑性共济失调（Autosomal-recessive cerebellar ataxias,ARCAs）是一类遗传性神经退行性疾病,表现为肢体运动的自主协调能力受损。其中常染色体隐性脊髓小脑共济失调症20（Autosomal recessive spinocerebellar ataxia 20,SCAR20）是新近报道的一种早发性ARCAs,临床表现为小脑萎缩、运动共济失调和严重的智力障碍等。对病人全外显子测序发现SCAR20是由sorting nexin 14（SNX14）基因功能缺失突变引起的。但由于缺乏合适的动物模型,SNX14突变致病的分子机制尚不明确,并缺乏有效的治疗方案。在本论文中,我们首先构建了Snx14在全脑条件性敲除的小鼠模型。经行为学和形态学检测发现,该小鼠能很好的模拟临床病人的表型,即小鼠表现出严重的运动共济失调,并出现大量小脑浦肯野细胞缺失。鉴于浦肯野细胞在运动协调中的关键作用,我们推测浦肯野细胞很可能在SCAR20的发生发展中起到关键作用。为了证明这一点,我们构建了Snx14在小脑浦肯野细胞中特异性敲除的小鼠模型（Snx14 cKO）。行为测试发现,Snx14 cKO小鼠出现渐进性的运动共济失调;形态学上,Snx14 cKO小鼠小脑浦肯野细胞出现年龄依赖的缺失,小胶质细胞也被大量激活,伴随炎症因子释放增加,并且浦肯野细胞的缺失与炎症反应呈正相关。进一步研究发现,部分Snx14缺失的浦肯野细胞存在明显的轴突肿胀,且肿胀轴突中堆积了大量的细胞器（尤其是线粒体）。我们推测轴突中细胞器堆积和轴突运输障碍有关,我们利用活细胞成像监测了原代神经元轴突中线粒体的运输,发现Snx14缺失导致神经元中线粒体轴突运输障碍,表现为正向和逆向轴突运输的线粒体均减少,且正向运输减少更显著。轴突运输缺陷破坏线粒体在神经元中的正确运输,从而可能引起细胞能量供应异常。通过线粒体能量代谢测试,我们发现Snx14缺失的神经元中基础呼吸值和ATP产生均明显下降,这些证据提示Snx14缺失导致线粒体轴突运输缺陷和线粒体功能障碍。综上所述,通过构建Snx14条件性敲除小鼠模型,我们首次证实浦肯野细胞的自发性丢失是导致SCAR20发病的重要原因。SNX14缺陷可干扰轴突线粒体的正常运输,损害线粒体功能,从而导致了对能量需求旺盛的浦肯野细胞死亡。总之,我们从线粒体运输和能量代谢的视角阐明了 SNX14缺失引起浦肯野退行性病变的机制,揭示了 SNX14的神经生物学功能,为SCAR20的治疗研究提供新的动物模型和分子机制。

关键词： SNX14 小脑共济失调浦肯野细胞线粒体轴突运输

浦肯野细胞丢失机制在脊髓小脑性共济失调中的研究意义

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神经疾病与精神卫生 2015年第4期15卷 419-422页

作者：尹皓符辉卢祖能武汉大学人民医院神经内科 430060

小脑浦肯野细胞是小脑皮层中唯一的传出神经元，许多共济失调疾病的发生如脊髓小脑性共济失调（SCAs）等与浦肯野细胞的缺失、树突萎缩有关。SCAs的典型神经病理学改变是小脑萎缩、浦肯野细胞退行性变及丢失。现阶段对致病基因如何导致S... 详细信息

小脑浦肯野细胞是小脑皮层中唯一的传出神经元，许多共济失调疾病的发生如脊髓小脑性共济失调（SCAs）等与浦肯野细胞的缺失、树突萎缩有关。SCAs的典型神经病理学改变是小脑萎缩、浦肯野细胞退行性变及丢失。现阶段对致病基因如何导致SCAs，尤其是导致浦肯野细胞丢失的细胞与分子生物学机制尚不清楚。现总结近年来浦肯野细胞丢失机制在SCAs中的研究进展，尤其是针对阻止浦肯野细胞丢失机制的研究进展，为SCAs治疗靶点提供更全面的了解。

关键词：浦肯野细胞脊髓小脑共济失调离子通道信号通路综述文献

丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性活动的影响

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中国老年学杂志 2017年第1期37卷 17-19页

作者：吕冰邱德来初春平金日金文哲延边大学附属医院疼痛科吉林延吉133000 吉林省细胞功能与药理重点实验室延边大学医学部生理学与病理生理学教研室延边大学附属医院骨科

目的探讨丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性单纯性放电活动、自发性复杂峰电位放电特性的影响。方法选用6~8周龄ICR小鼠6只,腹腔注射乌拉坦麻醉,在小脑CrusⅡ小叶行开颅手术,开孔直径为1.0~1.5 mm,去除硬脑膜后,用蠕动泵在脑表... 详细信息

目的探讨丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性单纯性放电活动、自发性复杂峰电位放电特性的影响。方法选用6~8周龄ICR小鼠6只,腹腔注射乌拉坦麻醉,在小脑CrusⅡ小叶行开颅手术,开孔直径为1.0~1.5 mm,去除硬脑膜后,用蠕动泵在脑表面持续灌流含氧的人工脑脊液,浦肯野细胞贴附式记录使用Multi clamp700B膜片钳放大器,通过D/A转换器1440和Clampfit 10.3软件获取浦肯野细胞自发性活动数据。待自发性活动记录稳定后,给予丙泊酚,观察其对浦肯野细胞自发性单纯峰电位(SS)和复杂峰电位(CS)活动的影响。结果脑表面给予丙泊酚剂量依存地抑制小鼠小脑浦肯野细胞自发性SS放电活动,其半数抑制浓度为143μmol/L,当浓度为500μmol/L时自发性SS放电完全抑制,然而,丙泊酚对自发性复杂峰电位放电频率和波形特征无显著影响。结论在体条件下,脑表面灌流丙泊酚显著抑制浦肯野细胞自发性SS放电活动。

关键词：丙泊酚浦肯野细胞小脑皮层细胞贴附式记录

芍药苷抑制大鼠小脑浦肯野细胞对急性缺氧的功能反应

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中国病理生理杂志 2015年第4期31卷 664-668页

作者：任颖鸽谭晓丽陈静张静杜永平张月萍第四军医大学西京医院全军中医内科中心陕西西安710032 第四军医大学西京医院儿科脑发育研究室陕西西安710032

目的:研究芍药苷(paeoniflorin,Pae)对大鼠小脑浦肯野细胞(Purkinje cells,PCs)急性缺氧电生理反应的影响。方法:采用全细胞膜片钳记录法,记录大鼠小脑PCs膜电位、兴奋性和平行纤维(parallel fibre,PF)-PC兴奋性突触后电流(excitatory p... 详细信息

目的:研究芍药苷(paeoniflorin,Pae)对大鼠小脑浦肯野细胞(Purkinje cells,PCs)急性缺氧电生理反应的影响。方法:采用全细胞膜片钳记录法,记录大鼠小脑PCs膜电位、兴奋性和平行纤维(parallel fibre,PF)-PC兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs),观察急性缺氧和芍药苷对上述电生理功能的影响。结果:缺氧后PCs首先表现为短暂的超极化,继之以短暂的去极化和持续超极化,芍药苷完全阻断了PCs的缺氧性超极化,并使PCs缺氧性去极化的幅度减小,持续时间缩短;缺氧上调了PCs兴奋性,芍药苷对缺氧引起的PCs的高兴奋性无显著影响;急性缺氧引起了PF-PC EPSCs的长时程抑制(long-term depression,LTD);芍药苷可部分逆转缺氧引起的PF-PC EPSCs衰减。结论:芍药苷显著减轻了大鼠小脑PCs的缺氧反应,可能增强了PCs对急性缺氧的耐受性。

关键词：芍药苷缺氧浦肯野细胞膜电位突触传递

成年鸡小脑浦肯野细胞向海马结构及副高纹状体直接投射的透射电镜观察

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解剖学杂志 2018年第1期41卷 55-59页

作者：张集祥孔雪王军王政富陈芳赵海全刘为民佛山科学技术学院佛山528231

目的:在成年鸡观察小脑浦肯野细胞向端脑海马结构和副高纹状体的直接投射。方法:选择4月龄以上的成年鸡,开颅,直流电损毁小脑Ⅵ叶皮质,动物存活7d,透射电镜观察端脑海马结构的海马(Hp)、旁海马内侧区(APHm)和副高纹状体(HA)前后部分及... 详细信息

目的:在成年鸡观察小脑浦肯野细胞向端脑海马结构和副高纹状体的直接投射。方法:选择4月龄以上的成年鸡,开颅,直流电损毁小脑Ⅵ叶皮质,动物存活7d,透射电镜观察端脑海马结构的海马(Hp)、旁海马内侧区(APHm)和副高纹状体(HA)前后部分及端脑谷部位(Va)的超微结构变化。结果:在Hp、APHm内均可观察到大量的溃变终末和少量的溃变纤维,在HA的前后部位可观察到少量溃变终末,在Va未能观察到溃变终末。结论:成年鸡小脑有向海马结构、副高纹状体的直接投射,且其直接投射的主要部位为海马结构。

关键词：鸡小脑浦肯野细胞海马结构直接投射透射电镜

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NMDA受体介导浦肯野细胞响应机制研究

NMDA受体介导浦肯野细胞响应机制研究

作者：黄慧玲西安电子科技大学

学位级别：硕士

浦肯野细胞接收来自平行纤维的刺激输入并通过突触实现信息整合。传统认为,突触处只有AMPA受体表达影响浦肯野细胞放电,然而近来研究发现NMDA受体也存在于突触处,但其如何影响浦肯野细胞放电知之甚少。因此,本文聚焦研究NMDA受体介导浦... 详细信息

浦肯野细胞接收来自平行纤维的刺激输入并通过突触实现信息整合。传统认为,突触处只有AMPA受体表达影响浦肯野细胞放电,然而近来研究发现NMDA受体也存在于突触处,但其如何影响浦肯野细胞放电知之甚少。因此,本文聚焦研究NMDA受体介导浦肯野细胞响应机制,主要研究内容包括:(1)本文首先分析NMDA受体在浦肯野细胞放电响应中的作用,研究基于NMDA受体表达的浦肯野细胞模型。该模型在传统浦肯野细胞模型基础上,引入NMDA受体接收来自平行纤维的刺激信号,并经由浦肯野细胞树突与细胞体处理输出简单尖峰;随后,本文结合刺激模式和NMDA受体强度变化,从简单尖峰频率编码、时间编码和相位调制角度分析NMDA受体作用。实验结果表明,在低频泊松刺激下NMDA受体增加浦肯野细胞的放电频率,而在高频泊松刺激下抑制其放电;此外,NMDA受体表达会减小放电序列的离散度并增加局部规则性;最后,NMDA受体会导致正弦输入下浦肯野细胞简单尖峰输出相位提前。(2)浦肯野细胞的放电机制不仅与突触输入有关,同时受到神经元内在特性调控。鉴于此,本文从神经元内在计算特性出发,分别从树突离子电流与突触位置分布两个角度探索NMDA受体在浦肯野细胞放电中的抑制特性。实验结果表明,高阈值钙激活钾通道和延迟整流钾通道是导致NMDA受体抑制浦肯野细胞放电的关键离子通道,高阈值钙激活钾通道的过小电导会导致延迟整流钾通道电流呈现持续饱和状态,进而造成浦肯野细胞无法正常放电。同时,突触分布位置会影响NMDA受体对浦肯野细胞放电的抑制作用,当NMDA受体分布在距离细胞体越近或直径太大的树突上时,其抑制作用更强。综上所述,本文在构建基于NMDA受体表达的浦肯野细胞模型的前提下,不仅从频率编码、时间编码以及相位调制角度分析了NMDA受体在浦肯野细胞放电响应中的作用机制,而且基于神经元内在计算特性分析NMDA受体抑制作用的生物基础。本文的研究有助于深入理解浦肯野细胞与平行纤维间的信息传递,进而丰富小脑信息传输中的突触整合机制。

关键词：浦肯野细胞 NMDA受体神经元响应机制树突内在特性

Eftud2在浦肯野神经元发育和小胶质细胞活化中的功能及作用机制研究

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Eftud2在浦肯野神经元发育和小胶质细胞活化中的功能及作用机制研...

作者：杨国超青岛大学

学位级别：硕士

延伸因子Tu GTP结合域包含2(Eftud2)作为RNA剪接体U5 sn RNPs的重要组成部分,在RNA剪接过程中发挥了重要作用。在斑马鱼的突变体中,Eftud2被证明能够调控神经祖细胞的命运。另一方面,小鼠神经嵴细胞中特异性缺失Eftud2能够导致小鼠颅面... 详细信息

延伸因子Tu GTP结合域包含2(Eftud2)作为RNA剪接体U5 sn RNPs的重要组成部分,在RNA剪接过程中发挥了重要作用。在斑马鱼的突变体中,Eftud2被证明能够调控神经祖细胞的命运。另一方面,小鼠神经嵴细胞中特异性缺失Eftud2能够导致小鼠颅面部发育缺陷。然而Eftud2在小脑浦肯野细胞中的功能仍然一无所知。在本研究中,通过构建浦肯野细胞特异性敲除Eftud2小鼠模型(L7-Cre;Eftud2 c KO),我们揭示了Eftud2在浦肯野细胞中的功能。研究发现,小鼠浦肯野细胞中特异性敲除Eftud2并不影响小鼠存活,但会表现出共济失调、平衡能力受损以及社交缺陷等表型变化。组织形态学分析发现,L7-Cre;Eftud2c KO小鼠的浦肯野细胞首先表现为突触连接受损,随后出现渐进性的死亡。我们还进一步剖析了浦肯野细胞的死亡过程。研究发现,浦肯野细胞死亡过程中伴随着树突棘的丢失,树突复杂程度的减少。有趣的是,这些变化往往首先发生在靠近胞体端的树突,并逐渐累及至远离胞体端的树突。通过构建L7-Cre;Eftud2 c KO小鼠,我们证明了Eftud2对于浦肯野细胞存活至关重要。因此,我们接下来围绕浦肯野细胞死亡的表型和可能机制进行了深入研究。前期研究工作表明,在斑马鱼中缺失Eftud2可导致神经祖细胞中P53依赖性的细胞凋亡。在本研究中,我们在Eftud2缺失的浦肯野细胞中同样发现了凋亡的表型。并且在凋亡的同时,浦肯野细胞中的自噬被激活。我们随后通过药理学抑制剂分别抑制了凋亡与自噬,证实了自噬的激活可能是响应细胞死亡的自我保护机制。有意思的是,我们在Eftud2缺失的浦肯野细胞中除了观察到凋亡形态学改变,还发现了更多更小的线粒体。显然。线粒体的这种改变并不是由凋亡引起的,但却与另一种细胞死亡方式——铁死亡的形态学特征相符合。随后,我们证明了浦肯野细胞在缺失Eftud2后还发生了脂质过氧化。另一方面,我们发现铁死亡抑制剂Ferrostain-1能够显著挽救浦肯野细胞的死亡和树突的丢失。相关结果表明,Eftud2缺失的浦肯野细胞发生了铁死亡。最后,通过结合转录组测序,对Eftud2缺失导致浦肯野细胞发生铁死亡的分子机制进行了进一步探讨。我们发现,Eftud2缺失后,浦肯野细胞中发生了大量剪接事件的改变,其中主要以外显子跳跃和内含子保留为主。尤其值得一提的是,我们发现铁死亡相关基因Scd1和Sat1的转录变化显著。因此,我们推测Eftud2可能通过调节Scd1和或Sat1的可变剪接参与铁死亡的发生,但具体分子机制仍有待深入研究。小胶质细胞是固有免疫细胞,在中枢神经系统的免疫应答中起重要作用。前期研究结果表明,Eftud2参与了先天免疫调节,在限制病毒感染中发挥重要作用。然而,其在中枢神经系统中的关键免疫调控细胞—小胶质细胞中的作用尚不明了。在本研究中,我们首先发现Eftud2在脂多糖(LPS)诱导的炎症反应中持续上调。接着,我们构建了小胶质细胞特异性Eftud2敲除小鼠(CX3CR1-Cre ERT2;Eftud2 c KO),以期揭示Eftud2在小胶质细胞中的功能。我们发现,Eftud2缺失后可导致各个脑区(海马,纹状体,前额叶皮层,小脑)小胶质细胞数量明显增加。进一步分析发现Eftud2缺失小胶质细胞异常增殖。为了阐明Eftud2在小胶质细胞中的功能,我们又分析了Eftud2缺失后不同脑区中小胶质细胞的形态学改变。结果表明,Eftud2缺失小胶质细胞表现出类似阿米巴样的激活形态,即更短的分支,更少的分支点与末端点以及增大的胞体。目前认为,小胶质细胞的激活主要分为两种类型,即促炎亚型和抗炎亚型。我们的体内和体外结果都表明,Eftud2缺失可导致小胶质细胞抗炎表型的激活。此外,我们还发现Eftud2介导的小胶质细胞抗炎表型激活可能依赖于NF-κB信号通路活化。因此,我们的研究结果表明,Eftud2在调节大脑小胶质细胞稳态方面也发挥着关键作用。综上所述,本研究一方面揭示了Eftud2作为神经发育的重要调节因子,在小脑浦肯野细胞发育及存活维持中发挥重要调控功能,而且其作用可能通过抑制铁死亡的途径来发挥。由于浦肯野细胞的死亡与脊髓小脑共济失调等疾病密切相关。因此,我们的工作不仅对于深入理解调控浦肯野细胞存活的分子机制具有重要的意义,同时有望为浦肯野细胞相关疾病的靶向治疗提供新的靶点。另一方面,本研究还揭示了Eftud2作为先天免疫调节因子,在中枢小胶质细胞促炎/抗炎表型调节中同样发挥重要作用。鉴于小胶质细胞在脊髓损伤、中风、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病发生发展中的作用已被广泛报道,因此,我们的工作也为深入揭示和理解中枢神经细胞中小胶质细胞的活化机制和在脑重大疾病发生进程中的作用机理提供了新的实验证据。

关键词：浦肯野细胞小胶质细胞 Eftud2 铁死亡炎症反应