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VEGFR2抑制剂的虚拟筛选、分子动力学模拟及活性验证

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今日药学 2024年

作者：王培莉杨娟曾宣蒯振彧马鞍山职业技术学院医学护理系

目的运用计算机辅助药物设计技术，将中药小分子化合物与血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2，VEGFR2）进行虚拟筛选。方法使用 Discovery Studio 2023软件的对蛋白进行模型评估，运用虚拟筛选技... 详细信息

目的运用计算机辅助药物设计技术，将中药小分子化合物与血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2，VEGFR2）进行虚拟筛选。方法使用 Discovery Studio 2023软件的对蛋白进行模型评估，运用虚拟筛选技术进行高通量筛选和精准筛选，并对筛选出的中药化合物分子进行ADMET性质预测，并对优选化合物进行体外活性测试，利用分子对接分析化合物与VEGFR2蛋白的相互作用模式，并对最优化合物进行分子动力学模拟。结果筛选出9个与VEGFR2蛋白具有高结合能力的化合物，其中苦参酚E、新乌拉尔醇和败酱苷B对VEGFR2蛋白有较强的亲和作用，Kd值分别为21、10、和25 μmol·L-1，抗肿瘤实验表明新乌拉尔醇对人胃癌细胞 SGC7901的抑制活性优于5-氟尿嘧啶，并与VEGFR2蛋白之间形成了多个氢键的结合模式，动力学模拟显示新乌拉尔醇与VEGFR2蛋白结合牢固。结论筛选得到的新乌拉尔醇具有作为VEGFR2蛋白小分子抑制剂的潜力，为新型VEGFR2抑制剂的发现提供参考。

关键词：血管内皮生长因子受体2 虚拟筛选分子动力学模拟活性验证

应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证

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生物技术通报 2022年第8期38卷 60-68页

作者：高伟欣黄火清赵晶张鑫杨宁杨浩萌中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleop... 详细信息

CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleoprotein)复合体。目前,应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多,成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段。本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了Cas9蛋白,并通过His-tag亲和树脂对重组Cas9蛋白进行了纯化;同时,通过T7转录试剂盒对gRNA进行体外转录和纯化,使纯化的Cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体,经体外活性检测,RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性;将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株,成功敲除了目标蛋白,编辑效率达到90%以上。本研究获得的RNP复合体,可以应用于丝状真菌的基因编辑,节约了试验时间与成本,并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用。

关键词： Cas9蛋白 RNP复合体大肠杆菌活性验证

新型冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂的虚拟筛选与活性验证

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华西药学杂志 2022年第1期37卷 1-5页

作者：汪益妃乔婧昕黎文培李琳丽四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室四川成都610041 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室四川成都610041

目的通过分子对接的虚拟筛选和体外酶活性测试,获得具有新型骨架结构的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PL^(pro))抑制剂。方法利用分子对接筛选商业化合物库与自有化合物库,根据打分排序以及相互作用模式分析,挑选苗头化合物,通过荧光共振能... 详细信息

目的通过分子对接的虚拟筛选和体外酶活性测试,获得具有新型骨架结构的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PL^(pro))抑制剂。方法利用分子对接筛选商业化合物库与自有化合物库,根据打分排序以及相互作用模式分析,挑选苗头化合物,通过荧光共振能量转移法测定化合物对PL^(pro)酶活性的抑制效力。结果从分子对接后的打分排序以及相互作用模式分析中,挑选了20个分子。通过FRET方法测试酶活性,发现了2个化合物(Y949、C528)对新型冠状病毒PL^(pro)具有抑制活性,其半数最大抑制浓度分别为97.7、145.0μmol·L^(-1)。结论通过虚拟筛选和体外酶活性测试,获得了两个具有新骨架结构的PL^(pro)抑制剂,为靶向PL^(pro)抗新型冠状病毒创新药物的研发提供了苗头化合物。

关键词：新型冠状病毒非结构蛋白木瓜样蛋白酶虚拟筛选分子对接活性验证小分子抑制剂新型骨架

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固相合成活性肽工艺优化及活性验证

固相合成活性肽工艺优化及活性验证

作者：王浙锋福州大学

学位级别：硕士

固相合成多肽（SPPS）技术是将要合成肽链的C端氨基酸先连接在固相载体上，通过N末端逐个加氨基酸的方法。自从1963年著名生化学家Merrifield发表了第一篇以固相树脂为载体合成四肽的文章后，经过近50年的发展与完善，固相合成多肽技术... 详细信息

固相合成多肽（SPPS）技术是将要合成肽链的C端氨基酸先连接在固相载体上，通过N末端逐个加氨基酸的方法。自从1963年著名生化学家Merrifield发表了第一篇以固相树脂为载体合成四肽的文章后，经过近50年的发展与完善，固相合成多肽技术由于其方便快速、可自动化的优点，成为了多肽合成中的一种首选方法。而如何降低固相合成中试剂毒性、副产物干扰，提高多肽合成的效率和产率，以及降低昂贵的费用等问题一直都是固相合成研究中的重要方向。本研究课题中合成的VR-6、LS-7序列是运用生物信息学方法筛选出来的生物活性多肽（序列由导师提供，因申请专利保护，不便公开）。通过生物信息学方法预测，VR-6、LS-7对癌细胞有抑制作用。树脂与首个氨基酸的连接率决定着目标肽链的得率。本研究课题针对固相合成中关键原料：树脂、氨基酸、DCC（N’N-二环己基碳二亚胺）、HOBt（N-羟基苯并三氮唑）、DMAP（二甲基氨基吡啶）的用量，将这些原料分组成3个因素，设计正交试验获得首个氨基酸与树脂最优连接率时的配比。正交设计以树脂固定为1eq（0.2mmol，一个计量单位），氨基酸与DCC为因素一，HOBt为因素二，DMAP为因素三，每个因素做三个水平（因素一、二的水平取2eq、3eq、4eq，因素三的水平取0.3eq、0.4eq、0.5eq）。最后对正交数据分析，得到连接率最优配比，并对各个配比进行成本核算，比较得出最优的工艺条件。最后运用获得的最优工艺条件指导实践中活性多肽（VR-6、LS-7）的合成，并验证合其活性。以合成VR-6为例，最终结果表明，与常用的高得率（74.58%）方法相比，按照本研究课题的优化工艺合成的得率（80.58%）提高了整整五个百分点，且大幅降低了合成的成本。利用MTT法对合成多肽的活性进行细胞试验，结果表明，VR-6、LS-7对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞SGC7901有明显的抑制作用。VR-6对肝癌细胞与胃癌细胞的最高抑制率浓度均为10μmol;LS-7对肝癌细胞与胃癌细胞的最高抑制率浓度也为10μmol。

关键词：固相合成活性多肽工艺优化正交设计活性验证

人白介素18在大肠杆菌中的表达、纯化及活性初步验证

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人白介素18在大肠杆菌中的表达、纯化及活性初步验证

作者：梁宁武汉大学

学位级别：硕士

白介素18是白介素家族的一重要成员,与IL-1β相似,作为一个独特的细胞因子,参与机体免疫反应过程,对机体起着重要免疫调节作用。白介素18被合成一种没有活性的前体,通常在Caspase-1的作用下将其加工成具有活性的细胞因子,执行不同的生... 详细信息

白介素18是白介素家族的一重要成员,与IL-1β相似,作为一个独特的细胞因子,参与机体免疫反应过程,对机体起着重要免疫调节作用。白介素18被合成一种没有活性的前体,通常在Caspase-1的作用下将其加工成具有活性的细胞因子,执行不同的生物功能:如IL-18参与Th1与Th2免疫反应激活细胞反应,诱导不同细胞中IFN-γ的产生,白介素18可刺激NK细胞产生白介素3、9等从而增强FasFasL诱导的细胞毒效作用;也可以刺激肥大细胞、嗜碱性细胞产生白介素4、13、组胺等化学物质,如此可见,白介素18是具有多种细胞生物功能的一类多效性细胞因子。IL-18通过与不同类型细胞上特定的表受体白介素18受体结合而表现出独特的生物功能;同时其活性的高低通常由IL18-BP平衡。人类的某些疾病的严重程度与病患体内的IL-18和IL18-BP失衡有关,因此导致游离在体内的白介素18急剧升高。越来越多的研究证实IL-18在调节动物体内剧烈的炎症反应方面起着十分重要的作用:IL-18与心肌功能,肺气肿,代谢综合征,牛皮癣,炎症性肠病,吞噬细胞综合症,巨噬细胞活化综合症,败血症和急性肾损伤等多种自身免疫疾病有着密切关系;特别是IL-18可以通过和IL-12的协同作用,激活NK细胞产生IFNγ,从而提高对肿瘤细胞的细胞毒性,因此IL-18可作为一种抗肿瘤疗法对抗肿瘤扩散。总而言之,IL-18在多种疾病的诊治、增强机体免疫机能方面都有巨大的研究和应用价值。但从目前的研究来看,实验室所研究、表达出的人IL-18蛋白产量低、操作复杂且普遍没有活性,因此本实验从基因着手,优化并重新改造目的基因,筛选适用于蛋白质表达的质粒与大肠杆菌,探究最适合工业生产的表达、纯化条件,为IL-18的基础研究和临床应用研究打基础。本实验通过将优化过的人白介素18基因连接到pET28b质粒上,构成重组表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达并筛选最适合工业化表达的条件;同时,利用亲和层析法分离纯化表达产物,得到终浓度为0.7mg/mL的重组蛋白并通过PBMC细胞法,初步简单、快速验证重组蛋白是否具有活性,具体实验成果如下:①优化并定向改造hIL18基因,如在序列末端添加His tag便于纯化等操作;②采用双酶切反应方法构建表达载体并利用化学转化法,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞中;经过测序等方法鉴定后确认序列100%比对;③经过不同档温度、不同浓度的诱导剂组合的表达测试,得出最适合工业生产的诱导条件为:IPTG浓度为1mM,低温16℃培育16h;经过镍柱亲和层析纯化表达产物后,Bradford法测得目的蛋白表达浓度为0.7mg/mL;④重组蛋白在PHA的协同作用下,可以促进PBMC细胞的增殖。综上所述,本实验通过构建重组表达载体,实现在大肠杆菌中进行可溶性表达,初步鉴定蛋白产物的活性,并有效提高了目的蛋白的产量,为IL-18的工业批量化生产提供根据,为IL-18的基础研究和临床应用研究打基础。

关键词：白介素18 表达纯化活性验证

基于网络药理学和分子对接研究青果-槐花药对抗幽门螺杆菌感染的活性成分和作用机制

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中国现代应用药学 2022年第4期39卷 429-436页

作者：严家慧申雪彭昶张唯佳陈鹏婷江琤张燕玲甘国兴朱卫星姚美村中山大学药学院广州510006 中山大学药学院(深圳) 广东深圳518107 北京中医药大学中药学院北京100102 清远市中医院广东清远511500 广东省鲜药民族医药工程技术研究中心广东清远511500

目的基于网络药理学和分子对接的方法研究青果-槐花药对抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染可能的活性成分和作用机制。方法利用TCMSP数据库及文献检索获取青果、槐花的活性成分,TCMSP、BATMAN-TCM、SwissTargetPrediction数据... 详细信息

目的基于网络药理学和分子对接的方法研究青果-槐花药对抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染可能的活性成分和作用机制。方法利用TCMSP数据库及文献检索获取青果、槐花的活性成分,TCMSP、BATMAN-TCM、SwissTargetPrediction数据库获取成分靶标。通过Genecards、Drugbank和DisGeNET数据库收集与Hp感染相关的靶标,并与成分靶标相比较,筛选出潜在靶标。利用STRING数据库获取潜在靶标之间的相互关系,筛选出核心靶标。在DAVID数据库中进行潜在靶标的GO分类富集分析和KEGG通路富集分析。通过Autodock进行核心靶标与活性成分的分子对接。最后用体外抗菌试验验证青果-槐花的抗菌活性。结果共收集到青果-槐花药对的20个主要活性成分,通过调节154个潜在靶标参与疾病过程,涉及TNF、FoxO、Toll样受体等通路的作用。活性成分中槲皮素、染料木素、山柰酚、鞣花酸与核心靶标具有良好的结合能力,可能通过作用于TP53、AKT1、IL6等靶标,干扰Hp的侵入和定植。青果-槐花药对抗Hp活性强于单药,其最小抑菌浓度为1.25 mg·mL;。结论本研究探索了青果-槐花药对抗Hp感染可能的活性成分、靶标和通路,其作用机制复杂多样,符合中医药治疗疾病的多成分、多靶点、多途径的作用特点,为青果-槐花药对治疗Hp感染提供了理论依据。

关键词：青果槐花幽门螺杆菌网络药理学分子对接活性验证

高效切割Hipp11敲入位点的sgRNA设计及活性验证

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实验动物科学 2015年第5期32卷 26-30页

作者：吴曦周舒雅刘甦苏谷文达左琴李保文贺争鸣范昌发中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所国家啮齿类实验动物种子中心北京100050

目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sg... 详细信息

目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sgRNA的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 m RNA一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11位点切割效率,计算出sgRNA的体内活性。结果两个sgRNA的体外活性分别为19.2%和51.7%,使用体外活性高的2号sgRNA显微注射获得8只新生小鼠,其中62.5%(5/8)的小鼠中检测到Hipp11位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR技术在Hipp11位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA体外活性能够预测sgRNA在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA的有效手段。

关键词：基因定点插入 Hipp11位点 CRISPR/Cas9 sgRNA 活性验证

原核表达重组KLK7及其在胰腺癌细胞中的活性研究

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原核表达重组KLK7及其在胰腺癌细胞中的活性研究

作者：涂先聪三峡大学

学位级别：硕士

研究背景:综合国内外研究和课题组前期研究表明,组织激肽释放酶7(kallikrein-related peptidase 7,KLK7)可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制、沉默、敲低和敲除KLK7均可降低胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,还可导致胰腺... 详细信息

研究背景:综合国内外研究和课题组前期研究表明,组织激肽释放酶7(kallikrein-related peptidase 7,KLK7)可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制、沉默、敲低和敲除KLK7均可降低胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,还可导致胰腺癌细胞发生铁死亡。目的:在本研究中,采用原核表达、纯化出活性KLK7蛋白,并将其回补到KLK7缺失的胰腺癌细胞中,探究其对胰腺癌细胞功能的影响,为KLK7作为胰腺癌的潜在治疗靶点提供科学依据。方法:(1)利用分子克隆技术构建p GEX-6P-1-KLK7原核表达载体。(2)利用原核表达系统表达GST-KLK7蛋白。(3)采用GST亲和磁珠纯化GST-KLK7,随即采用肠激酶剪切GST,活化KLK7。(4)使用酶标法鉴定KLK7活性。(5)通过挽救实验验证KLK7蛋白在胰腺癌细胞中的活性功能:采用CCK8法、实时细胞检测技术和克隆形成实验评价KLK7活性蛋白对KLK7缺失的胰腺癌细胞株的增殖能力的影响;Western Blot实验检测回补KLK7活性蛋白对KLK7缺失引起的胰腺癌细胞铁死亡的逆转作用;采用划痕实验和Transwell实验评价回补KLK7活性蛋白对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)成功构建p GEX-6P-1-KLK7原核表达载体。(2)成功利用原核表达系统表达GST-KLK7重组蛋白,并采用GST亲和磁珠纯化GST-KLK7重组蛋白,经剪切活化得到KLK7蛋白。(3)回补KLK7活性蛋白,可显著提高胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。(4)回补KLK7活性蛋白能够在一定程度上逆转KLK7缺失造成的铁死亡。结论:本研究表明,原核表达出具有活性的KLK7蛋白可显著提高KLK7缺失的胰腺癌细胞PANC-1的增殖、迁移和侵袭的能力,且可逆转KLK7缺失引起的铁死亡,为KLK7作为胰腺癌的潜在治疗靶点提供科学依据。

关键词：组织激肽释放酶7 原核表达回补实验活性验证

美洲大蠊内生菌几丁质酶基因的克隆、表达及其活性研究

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中国生物工程杂志 2019年第1期39卷 31-37页

作者：许敏华张晶晶金小宝李小波王艳马艳广东药科大学广东省生物活性药物研究重点实验室广州510006

目的:对美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因进行克隆、可溶性表达及功能验证。方法:PCR扩增ChiA基因,TA亚克隆,构建重组表达载体ChiA/p ET21b,生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western blot鉴定,打孔法对几丁质酶活性... 详细信息

目的:对美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因进行克隆、可溶性表达及功能验证。方法:PCR扩增ChiA基因,TA亚克隆,构建重组表达载体ChiA/p ET21b,生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western blot鉴定,打孔法对几丁质酶活性检测。结果:PCR成功扩增了ChiA基因序列,该序列与GenBank上的S. marcescens ChiA基因序列同源性达99%;该序列编码571个氨基酸,并能够在原核系统中稳定表达。可溶性表达分析显示:通过低温诱导表达,获得可溶性的目的蛋白;活性试验发现:含目的蛋白的表达产物可分解几丁质,且活性强于美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌。结论:从美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌基因组中成功克隆了几丁质酶ChiA基因,通过原核表达系统获得了具有较强活性的可溶性几丁质酶ChiA,为其应用奠定了基础。

关键词：美洲大蠊黏质沙雷氏菌几丁质酶ChiA 可溶性表达活性验证