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解密泛素链的亲和工具

生物化学与生物物理进展 2019年第9期46卷 845-857页

作者：李贞赵博上海交通大学细胞工程和抗体药物教育部工程研究中心上海交通大学药学院

泛素化是最具多样性的蛋白质翻译后修饰之一,广泛参与蛋白质降解、细胞信号转导、DNA损伤修复等重要的生物学过程.其中,泛素的8个位点(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)都可以与另一个泛素分子的C末端结合,形成结构复杂的泛素链.... 详细信息

泛素化是最具多样性的蛋白质翻译后修饰之一,广泛参与蛋白质降解、细胞信号转导、DNA损伤修复等重要的生物学过程.其中,泛素的8个位点(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)都可以与另一个泛素分子的C末端结合,形成结构复杂的泛素链.不同结构泛素链的功能不同.由于缺乏检测泛素链的特异性工具,许多类型泛素链的功能尚未清楚.已开发的泛素连接特异性抗体等亲和试剂为研究泛素链提供了重要的分析工具.本文综述了目前已报道的几种泛素连接特异性抗体的开发以及应用,同时总结了其他可分析泛素链的特异性亲和工具,例如Affimer、基于UBD的荧光传感蛋白等.同时,本文还对开发泛素连接特异性抗体所需抗原的获得方法进行了简单的介绍.

关键词：泛素链泛素泛素化泛素连接特异性抗体抗体库技术

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泛素、泛素链和蛋白质泛素化研究进展

生物工程学报 2016年第1期32卷 14-30页

作者：兰秋艳高媛李衍常洪学传徐平武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室湖北武汉430072 军事医学科学院放射与辐射医学研究所国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京102206

蛋白质泛素化是以泛素单体和泛素链作为信号分子,共价修饰细胞内其他蛋白质的一种翻译后修饰形式。不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点以及同一位点上泛素链连接方式的不同均可导致细胞效应的差异。蛋白质泛素化在真核细胞... 详细信息

蛋白质泛素化是以泛素单体和泛素链作为信号分子,共价修饰细胞内其他蛋白质的一种翻译后修饰形式。不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点以及同一位点上泛素链连接方式的不同均可导致细胞效应的差异。蛋白质泛素化在真核细胞内广泛存在,除了介导蛋白质的26S蛋白酶体降解途径之外,还广泛参与了基因转录、蛋白质翻译、信号传导、细胞周期控制以及生长发育等几乎所有的生命活动过程。泛素链的形成及其修饰过程的任何失调均可导致生物体内环境的紊乱,从而产生严重的疾病。文中结合实验室研究,综述了泛素的发现历史、基因特点、晶体结构,特别是泛素链的组装过程、结构、功能以及与人类相关疾病关系的新进展,可为这些疾病的治疗靶点和药物靶标的研究提供思路。

关键词：泛素泛素链晶体结构赖氨酸残基疾病

泛素连接酶E3与泛素链修饰类型特异性研究进展

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生命科学 2017年第8期29卷 722-731页

作者：陈杨王富强徐平军事医学科学院放射与辐射医学研究所国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室北京102206

泛素化修饰是真核细胞内广泛存在的一种修饰形式,受到该修饰的蛋白质分子遍及基因转录、蛋白质翻译、信号转导、细胞周期控制以及生长发育等几乎所有的生命活动过程,对生命体正常功能的发挥具有重要作用。泛素化修饰的失调会给生命体带... 详细信息

泛素化修饰是真核细胞内广泛存在的一种修饰形式,受到该修饰的蛋白质分子遍及基因转录、蛋白质翻译、信号转导、细胞周期控制以及生长发育等几乎所有的生命活动过程,对生命体正常功能的发挥具有重要作用。泛素化修饰的失调会给生命体带来一系列负面影响,严重者将导致疾病,甚至危及生命。泛素连接酶E3是泛素化修饰反应中底物特异性的直接决定者,其机制研究不仅可揭示蛋白质质量控制和生命活动功能的奥秘,也将为疾病关联失调蛋白的精准调控和精准医学实践提供技术支撑。现结合当前对泛素连接酶E3研究的最新进展,阐述泛素连接酶E3发挥作用时与不同类型泛素链之间的特异性关系,旨在为蛋白质功能调控的分子机制、药物研制和疾病诊治提供新思路。

关键词：泛素泛素连接酶泛素链特异性赖氨酸残基疾病

Ubp2特异性调控Lsb1泛素链状态及其功能的定量蛋白质组学研究

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Ubp2特异性调控Lsb1泛素链状态及其功能的定量蛋白质组学研究

作者：罗维佳安徽医科大学

学位级别：硕士

泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是真核细胞特异性降解蛋白质的主要场所,实现蛋白质质、量的精准调控,影响甚至决定了细胞周期、免疫应答和信号传递等几乎所有的生命活动过程。蛋白的泛素化需要E1,E2和E3级联反应... 详细信息

泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是真核细胞特异性降解蛋白质的主要场所,实现蛋白质质、量的精准调控,影响甚至决定了细胞周期、免疫应答和信号传递等几乎所有的生命活动过程。蛋白的泛素化需要E1,E2和E3级联反应,将泛素分子(Ub)转移到底物蛋白的不同赖氨酸上造成翻译后修饰的宏观不均一性。底物蛋白上的泛素分子又可继续被泛素修饰进而形成不同的泛素链修饰。而不同的泛素链发挥不同的生物学功能。去泛素化酶(DUBs)可将底物蛋白上的泛素链或泛素分子特异地水解下来,逆转泛素化过程,以维持泛素—蛋白酶体系统的平衡。其失调使UPS系统紊乱,从而导致人类诸多疾病。研究发现DUBs与泛素链之间存在特异性对应关系,但由于技术的限制,特定的DUBs调控其特异性底物的泛素链并参与到生物学过程的机制尚属未知,有待我们深入研究。在之前的研究中,我们以芽殖酵母为研究对象,系统评价了酵母所有DUB的泛素链的特异性,发现USP家族的Ubp2对K63链有偏好性。本课题以Ubp2的潜在底物Lsb1为研究对象,通过在其C端加上6×his和biotin双标签的策略来系统描述Lsb1。经过串联纯化和SDS-PAGE验证,我们得到了高纯度泛素化的Lsb1,证明我们的研究策略有效。纯化的样品经过LC-MS/MS高覆盖蛋白质组分析,我们证实Lsb1的K41和K79位点被泛素化,验证了以往的研究结果;与此同时我们还发现了K37、K85、K98和K108这4个新的泛素化位点。分别将主要的修饰残基的赖氨酸突变成精氨酸,并做SILAC-IP-MS精准定量蛋白质组分析,发现Lsb1蛋白上的K41和K79位点都含有K48和K63泛素链的修饰,其中K41位点主要为K63链修饰,而K79位点主要发生K48修饰,它们受到Ubp2,Ubp3和Ubp14调控。为阐明Lsb1受Ubp2调控的分子机制,我们开展了Lsb1特定泛素链的SILAC-Protein-Protein Interacting研究。经过SILAC定量和严格的筛选,我们鉴定了151个高可信的Lsb1相互作用蛋白,这些蛋白主要参与氨基酸代谢、蛋白折叠、细胞离子平衡、内吞作用等重要的生物学过程。在泛素链特异性结合的底物研究中,我们用相同的筛选条件得到了共45个与泛素链结合的蛋白,这群蛋白主要与支链氨基酸合成、蛋白折叠、锌离子跨膜转运等生物学过程。在随后的表型实验中也证明泛素化的Lsb1参与酵母支链氨基酸的合成,这与之前的功能分析吻合,也为我们深入研究Lsb1及其泛素链的生物学功能提供了参考。

关键词：去泛素化酶 Ubp2 Lsb1 泛素链定量蛋白质组学

特定泛素链修饰底物正向筛选技术建立和底物筛选研究

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特定泛素链修饰底物正向筛选技术建立和底物筛选研究

作者：李招娣重庆医科大学

学位级别：硕士

泛素分子是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在真核生物中高度保守。泛素分子在泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）的级联酶促反应下共价连接到底物蛋白上,形成泛素化修饰。去泛素化酶（DUBs）可以移除被修饰... 详细信息

泛素分子是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在真核生物中高度保守。泛素分子在泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）的级联酶促反应下共价连接到底物蛋白上,形成泛素化修饰。去泛素化酶（DUBs）可以移除被修饰底物蛋白上的泛素单体,使这一过程动态可逆。泛素化修饰广泛参与调控蛋白质质量控制和信号转导过程,其可逆性和高度动态的特征使得生物体众多的生物学进程得以有序进行,有效保持内环境的稳定。已加到底物蛋白上的泛素单体的7个赖氨酸残基及其N端甲硫氨酸的游离氨基均可被泛素分子继续修饰,进而生成泛素链。不同的泛素链有着不同的拓扑结构,能够传递不同的生物学信号,其时空紊乱会导致各种疾病的发生。然而目前缺乏有效的针对特定泛素链修饰底物的富集技术,极大的限制了对各种泛素链底物的发现及功能的认知。目的研究表明,泛素化与癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、感染性疾病以及遗传性疾病等密切相关,但是目前对其调控机制的探究尚且不够深入。酿酒酵母作为一种较为成熟的用于泛素化研究的模式生物,其泛素化网络与人类有一定的相似性。本研究的目的是在正常生长的酿酒酵母中,构建高可信的7种泛素链修饰底物数据集,为泛素密码解析提供必要的原始数据支撑,也为其他生物中特定泛素链修饰底物的发现与功能探究提供研究范例和原始创新性数据支撑。特定泛素链修饰底物的鉴定也为人类疾病发生发展进程中泛素化修饰信号失调及其分子机制研究以及未来药物研发提供新的靶点。方法在正向筛选策略中,用到了8种表达野生型泛素质粒以及K0-Ub、K6o-Ub、K11o-Ub、K27o-Ub、K29o-Ub、K33o-Ub、K48o-Ub和K63o-Ub的酿酒酵母[4个内源泛素基因已被敲除,非标签融合表达的泛素为质粒上的基因所补充（实验室前期基础）]。以K6o-Ub为例,其N端带有His-Myc亲和纯化标签,且泛素蛋白质中存在的7个赖氨酸残基只保留第6位的赖氨酸,其他赖氨酸均突变为精氨酸,因此理论上只能用于形成K6泛素链。为解决人工泛素修饰在最远端带帽产生的假阳性问题,7个赖氨酸位点均突变为精氨酸的K0-Ub被设置为对照,并转入载有无融合标签的野生型酵母菌株,使得酵母细胞存活但不提供可被双标签亲和富集的泛素链,从而用于解决Ni-NTA beads的非特异结合问题。为方便描述,我们将上述的8个表达人工泛素的菌株统称为K系列菌株。引入人工泛素后的菌株指数期的生长曲线与引入空载的菌株相似,生长趋势一致,指数生长期的倍增时间也无统计学变化。各菌株间的全蛋白质组相关性均达到95%,表明即使引入人工泛素,菌株的全蛋白质组也不受影响。亲和纯化得到特定泛素链修饰的蛋白质组样品,结合银染以及Western blot实验验证富集效果后,结合质谱以及生信分析得到K特定泛素链修饰底物数据集。结果共鉴定到996个潜在的特定泛素链修饰的底物蛋白。其中,包含275个K6链潜在底物,93个K11泛素链潜在底物,171个K27链潜在底物,533个K29链潜在底物,443个K33链潜在底物,280个K48链潜在底物以及655个K63链潜在底物。在这些泛素链中,K63链底物研究最多。本研究得到的K63链特异底物数据集与已发表的K63链潜在底物数据集相比,有70个蛋白是共有的,占我们鉴定的K63链潜在底物数据集的11.5%和已报导K63链修饰底物的26.8%。本研究得到的K63链潜在底物数据集还包括585个单独鉴定的潜在底物,说明我们所建立的特定泛素链修饰底物鉴定技术体系的特异、灵敏和高效性。这些潜在的K63链修饰底物参与了类固醇代谢、细胞极性维持、信息素依赖的细胞信号转导以及溶酶体自噬等多样的生物学过程,证明K63泛素链生物学功能的多样性。结论本研究成功建立不依赖泛素链抗体的特定泛素链修饰底物正向筛选体系;实现了对7种泛素链底物的筛选,得到了可信度较高的特定泛素链修饰底物数据集,为泛素链生物学功能研究提供关键候选底物蛋白,为泛素链功能研究提供新思路。本研究得到的数据集中包含大量未报导的潜在底物,为泛素化网络的认知及泛素链功能的解析提供了基础。

关键词：定量蛋白质组学泛素链泛素链特异底物