特定泛素链修饰底物正向筛选技术建立和底物筛选研究
作者单位：重庆医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：段昌柱;徐平;李衍常
授予年度：2022年
学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学]
摘 要：泛素分子是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白,在真核生物中高度保守。泛素分子在泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s）的级联酶促反应下共价连接到底物蛋白上,形成泛素化修饰。去泛素化酶（DUBs）可以移除被修饰底物蛋白上的泛素单体,使这一过程动态可逆。泛素化修饰广泛参与调控蛋白质质量控制和信号转导过程,其可逆性和高度动态的特征使得生物体众多的生物学进程得以有序进行,有效保持内环境的稳定。已加到底物蛋白上的泛素单体的7个赖氨酸残基及其N端甲硫氨酸的游离氨基均可被泛素分子继续修饰,进而生成泛素链。不同的泛素链有着不同的拓扑结构,能够传递不同的生物学信号,其时空紊乱会导致各种疾病的发生。然而目前缺乏有效的针对特定泛素链修饰底物的富集技术,极大的限制了对各种泛素链底物的发现及功能的认知。目的研究表明,泛素化与癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、感染性疾病以及遗传性疾病等密切相关,但是目前对其调控机制的探究尚且不够深入。酿酒酵母作为一种较为成熟的用于泛素化研究的模式生物,其泛素化网络与人类有一定的相似性。本研究的目的是在正常生长的酿酒酵母中,构建高可信的7种泛素链修饰底物数据集,为泛素密码解析提供必要的原始数据支撑,也为其他生物中特定泛素链修饰底物的发现与功能探究提供研究范例和原始创新性数据支撑。特定泛素链修饰底物的鉴定也为人类疾病发生发展进程中泛素化修饰信号失调及其分子机制研究以及未来药物研发提供新的靶点。方法在正向筛选策略中,用到了8种表达野生型泛素质粒以及K0-Ub、K6o-Ub、K11o-Ub、K27o-Ub、K29o-Ub、K33o-Ub、K48o-Ub和K63o-Ub的酿酒酵母[4个内源泛素基因已被敲除,非标签融合表达的泛素为质粒上的基因所补充（实验室前期基础）]。以K6o-Ub为例,其N端带有His-Myc亲和纯化标签,且泛素蛋白质中存在的7个赖氨酸残基只保留第6位的赖氨酸,其他赖氨酸均突变为精氨酸,因此理论上只能用于形成K6泛素链。为解决人工泛素修饰在最远端带帽产生的假阳性问题,7个赖氨酸位点均突变为精氨酸的K0-Ub被设置为对照,并转入载有无融合标签的野生型酵母菌株,使得酵母细胞存活但不提供可被双标签亲和富集的泛素链,从而用于解决Ni-NTA beads的非特异结合问题。为方便描述,我们将上述的8个表达人工泛素的菌株统称为K系列菌株。引入人工泛素后的菌株指数期的生长曲线与引入空载的菌株相似,生长趋势一致,指数生长期的倍增时间也无统计学变化。各菌株间的全蛋白质组相关性均达到95%,表明即使引入人工泛素,菌株的全蛋白质组也不受影响。亲和纯化得到特定泛素链修饰的蛋白质组样品,结合银染以及Western blot实验验证富集效果后,结合质谱以及生信分析得到K特定泛素链修饰底物数据集。结果共鉴定到996个潜在的特定泛素链修饰的底物蛋白。其中,包含275个K6链潜在底物,93个K11泛素链潜在底物,171个K27链潜在底物,533个K29链潜在底物,443个K33链潜在底物,280个K48链潜在底物以及655个K63链潜在底物。在这些泛素链中,K63链底物研究最多。本研究得到的K63链特异底物数据集与已发表的K63链潜在底物数据集相比,有70个蛋白是共有的,占我们鉴定的K63链潜在底物数据集的11.5%和已报导K63链修饰底物的26.8%。本研究得到的K63链潜在底物数据集还包括585个单独鉴定的潜在底物,说明我们所建立的特定泛素链修饰底物鉴定技术体系的特异、灵敏和高效性。这些潜在的K63链修饰底物参与了类固醇代谢、细胞极性维持、信息素依赖的细胞信号转导以及溶酶体自噬等多样的生物学过程,证明K63泛素链生物学功能的多样性。结论本研究成功建立不依赖泛素链抗体的特定泛素链修饰底物正向筛选体系;实现了对7种泛素链底物的筛选,得到了可信度较高的特定泛素链修饰底物数据集,为泛素链生物学功能研究提供关键候选底物蛋白,为泛素链功能研究提供新思路。本研究得到的数据集中包含大量未报导的潜在底物,为泛素化网络的认知及泛素链功能的解析提供了基础。
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