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河豚毒素快速检测技术在养殖河豚鱼监管中的应用

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食品安全质量检测学报 2016年第5期7卷 1851-1857页

作者：田娟娟许玉艳李晋成吴立冬王书刘欢中国水产科学研究院北京100141 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种分子量约为319的含氮生物碱,具有极高的毒性,食用河豚毒素含量高的河豚鱼易发生中毒事件。TTX含量的多少因河豚鱼的种类、部位及季节等而有差异,TTX主要集中于河豚的卵巢和肝脏,且在卵巢孕育阶段毒性最... 详细信息

河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种分子量约为319的含氮生物碱,具有极高的毒性,食用河豚毒素含量高的河豚鱼易发生中毒事件。TTX含量的多少因河豚鱼的种类、部位及季节等而有差异,TTX主要集中于河豚的卵巢和肝脏,且在卵巢孕育阶段毒性最强,河豚鱼肉(皮)、精囊无毒。日、韩等国对河豚鱼消费实行科学分类管理,严格区分了"可食用"和"不可食用"的河豚鱼品种、部位等。我国对河豚鱼一直实行"禁食"管理;然而,我国河豚鱼产业却处于"禁食而不禁养"状况,且在国内已形成了较大的"灰色"消费市场。本文梳理了近年来TTX的快速检测技术发展现状,并对快速检测技术在养殖河豚鱼监管中的应用发展前景进行探讨,以期为从事食品安全监管及快速检测技术研究工作的人员提供参考。

关键词：河豚毒素快速检测养殖河豚鱼监管

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河豚毒素免疫快速检测方法研究进展

福建分析测试 2016年第6期25卷 22-27页

作者：陈清爱福建商学院旅游系福建福州350012

河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是一种相对分子量小但毒性极高的非蛋白毒素,其存在于多种生物体中,对人类的健康构成严重威胁。河豚毒素快速检测方法是防止受污染河豚毒素食品进入百姓餐桌有效手段,其中免疫检测技术由于其高特异性、高灵... 详细信息

河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是一种相对分子量小但毒性极高的非蛋白毒素,其存在于多种生物体中,对人类的健康构成严重威胁。河豚毒素快速检测方法是防止受污染河豚毒素食品进入百姓餐桌有效手段,其中免疫检测技术由于其高特异性、高灵敏度及操作简便等优点受到人们的青睐,通过对国内外河豚毒素免疫快速检测方法的研究现状进行了阐述,并与目前已有的各种检测方法进行了比较,在此基础上对河豚毒素快速检测方法的研究方向进行了展望。

关键词：河豚毒素免疫检测酶联免疫吸附法胶体金免疫层析技术

鼠源CD40L的原核表达及其对河豚毒素半抗原免疫增强效果分析

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中国畜牧兽医 2019年第8期46卷 2438-2445页

作者：潘悦曹旗任洪林胡盼李岩松周玉柳增善卢士英吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病教育部重点实验室

试验旨在通过大肠杆菌表达系统表达鼠源重组CD40L蛋白,探讨其对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)人工完全抗原在免疫BALB/c小鼠过程中的免疫增强作用。用Trizol试剂提取BALB/c小鼠脾脏总RNA并反转录成cDNA,根据CD40L CDS区设计引物,PCR扩增... 详细信息

试验旨在通过大肠杆菌表达系统表达鼠源重组CD40L蛋白,探讨其对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)人工完全抗原在免疫BALB/c小鼠过程中的免疫增强作用。用Trizol试剂提取BALB/c小鼠脾脏总RNA并反转录成cDNA,根据CD40L CDS区设计引物,PCR扩增目的基因,构建pGEX4T-1重组载体,进行原核表达,并纯化重组CD40L蛋白;根据曼尼希反应原理,用甲醛法制备TTX免疫原TTX-BSA和检测原TTX-OVA;以人工重组蛋白CD40L佐剂组为试验组,弗氏佐剂组作为对照组,免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法结合SPSS 19.0软件分析各组免疫效果,探讨重组CD40L蛋白在TTX-BSA免疫过程中对免疫效果的影响。结果显示,本试验成功扩增了783 bp的CD40L目的基因,原核表达并纯化了融合GST标签的55 ku鼠源CD40L重组蛋白;与人工制备的TTX-BSA协同免疫小鼠试验结果显示,在免疫初期与弗氏佐剂相比,CD40L具有极显著的免疫增强效果(P<0.01)。综上所述,重组蛋白CD40L与TTX-BSA完全抗原协同免疫小鼠,在免疫初期CD40L具有增强机体对半抗原的应答强度的作用,为进一步开发适于小分子半抗原抗体高效制备的免疫增强佐剂奠定基础。

关键词： CD40L 佐剂河豚毒素免疫效果

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用于河豚毒素检测的电化学免疫传感器研究

用于河豚毒素检测的电化学免疫传感器研究

作者：刘铭丽上海海洋大学

学位级别：硕士

河豚鱼是我国各大海区的常见鲀科鱼类,品种众多,其体内含有的河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)为小分子非蛋白神经毒素,是海洋毒素中较为常见的一种,该毒素毒性极强,中毒潜伏期短,发作迅速,目前缺乏快速有效的救治措施。河豚鱼肉营养价值高,... 详细信息

河豚鱼是我国各大海区的常见鲀科鱼类,品种众多,其体内含有的河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)为小分子非蛋白神经毒素,是海洋毒素中较为常见的一种,该毒素毒性极强,中毒潜伏期短,发作迅速,目前缺乏快速有效的救治措施。河豚鱼肉营养价值高,同时味道鲜美,经济价值越来越受到关注。基于TTX的作用机制,纯提取物正在尝试应用于临床,在医学方面前景广阔。河豚鱼等水产品内残留的TTX对公共食品安全存在威胁,目前我国只允许红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)2种养殖河豚鱼的加工经营,市场监管力度需要进一步加大,对河豚鱼实行质量把控成为重中之重,因此对河豚鱼养殖、加工和贮藏和流通等阶段进行实时监管十分必要。目前对于河豚毒素已有多种检测技术,如何进一步实现河豚毒素的快速定性定量是促进新型检测方法开发的重要因素。本研究以电化学检测理论和免疫学分析为基础,构建了3种类型的电化学免疫传感器,同时优化反应条件,并分析了方法稳定性、重复性及回收率等可行性指标。另外,本研究中河豚鱼实际样品前处理方法简单,检测耗时较短,准确率较高,检出限符合国家标准,可以适应现场快速检测需求。本研究以开发TTX的电化学免疫传感器为主要目的,以期为TTX等小分子电化学免疫检测及痕量分析提供思路,主要研究结果如下:实际研究中以玻碳电极(工作电极),饱和甘汞电极(参比电极)和铂丝对电极(辅助电极)建立三电极系统,免疫传感器的构建及检测过程在此电化学体系下进行。1.以戊二醛为修饰基底的电化学免疫传感器的构建及其评价以竞争型酶联免疫吸附方法(ELISA)为基础,在玻碳电极界面上,以戊二醛为修饰基底,通过逐级修饰构建GCE/Glutaraldehyde/BSA-TTX/BSA传感器,修饰界面在溶液体系中与游离TTX竞争结合TTX抗体(anti-TTX),完成TTX检测过程。经条件优化得到的BSA最佳封闭浓度为2%,最佳孵育时间为90 min(37℃孵育)。TTX在2 ng/mL～1250 ng/mL内呈现为良好的线性关系(r>0.990),检出限(LOD,S/N>3)低至2.0 ng/mL,加标回收率为81.36%～96.96%,方法稳定性良好(RSD=5.27%,n=3)。以此为电化学免疫传感器的基础构建方法,在后续研究中选择不同类型的纳米材料增强检测过程中的电子传递速率并放大电信号,提高方法灵敏度。2.以壳聚糖为修饰基底的电化学免疫传感器及其评价壳聚糖(Chitosan,CS)分子结构中的氨基基团表面携带正电荷,可以与表征液中的阴离子[Fe(CN)]产生静电吸附,一定程度上增强了电极界面氧化还原电流强度,起到信号放大作用。在玻碳电极界面修饰壳聚糖,再经过逐级修饰构建GCE/CS/AuNPs-BSA-TTX/BSA传感器,通过竞争免疫检测不同浓度的TTX,最终修饰界面对anti-TTX的捕获量存在差异,进而影响GCE/CS/AuNPs-BSA-TTX/BSA/anti-TTX的表征效果。该传感器经条件优化后BSA的最适封闭浓度为2%,最佳孵育时间为60 min(37℃),TTX浓度的自然对数(Ln(c))与DPV峰电流变化量(ΔI)有较好的线性关系(r>0.955),检出限(LOD,S/N>3)同样为2.0ng/mL,加标回收率介于78.4%～105.74%之间,检出结果较稳定(RSD=5.06%,n=3)。3.以全氟磺酸为修饰基底的电化学免疫传感器及其评价全氟磺酸(Nafion)成膜性良好,稳定性强,作为一种聚阴离子全氟磺酸盐离聚物,可选择性透过电活性物质Ru(bpy),增强电极界面传导效率。构建GCE/Nafion/AuNPs-BSA-TTX/BSA传感器后,通过抗原抗体的特异性结合影响界面信号响应,并进行检测分析。反应条件优化后得到BSA封闭浓度为1%,最佳孵育时间为60 min(37℃),TTX浓度的自然对数(Ln(c))与ACV峰电流变化量(ΔI)在2 ng/mL～1250 ng/mL内表现为负相关关系(r>0.990),LOD(S/N>3)=2.0 ng/mL,加标回收率为80.33%～115.44%,方法整体较稳定(RSD=4.24%,n=3)。

关键词：河豚毒素电化学免疫分析生物传感器胶体金戊二醛壳聚糖全氟磺酸

河豚毒素对电刺激诱发的兔隐动脉双相血管收缩反应的作用

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中国药理学通报 2005年第9期21卷 1123-1127页

作者：师晨霞任雷鸣李军霞河北医科大学药学院药理学研究室河北石家庄050017

目的采用兔离体隐动脉环标本,建立了双相血管收缩反应模型,并分析TTX(1～100 nmol·L-1)对两种收缩成分的影响.方法兔离体隐动脉血管环张力记录法及电场刺激诱发血管收缩法.结果本实验条件下的电场刺激(电压15 V、波宽1 ms、刺激频率2～... 详细信息

目的采用兔离体隐动脉环标本,建立了双相血管收缩反应模型,并分析TTX(1～100 nmol·L-1)对两种收缩成分的影响.方法兔离体隐动脉血管环张力记录法及电场刺激诱发血管收缩法.结果本实验条件下的电场刺激(电压15 V、波宽1 ms、刺激频率2～16 Hz,连续刺激时程32 s)可诱发兔离体隐动脉产生双相收缩反应,且具有频率(2～16Hz)依赖性.钠通道选择性阻滞剂TTX 3 nmol·L-1 对第一相收缩反应无影响,但是明显抑制第二相收缩反应,抑制率达44%～67%;TTX的浓度增加至10 nmol·L-1时,其对4～16 Hz电刺激诱发的第一相反应的抑制率为40%～57% ,而对第二相反应的抑制率达90%以上.TTX (0.1 μmol·L-1)对NA(0.01～30 μmol·L-1)的累积量效曲线无任何影响,但是完全抑制了电刺激诱发的动脉环双相收缩反应.胍乙啶(10 μmol·L-1)完全抑制电刺激诱发的双相收缩反应,但是不抑制外源性NA的收缩反应.结论建立了电场刺激诱发兔离体隐动脉环双相收缩反应模型,该双相收缩与交感神经兴奋及其递质的释放有关.

关键词：共递质交感神经电场刺激河豚毒素双相血管收缩兔隐动脉

液相色谱-串联质谱-内标法测定尿液中河豚毒素

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卫生研究 2024年第1期53卷 95-101页

作者：徐小民蔡增轩许娇娇郑熠斌徐美佳韩见龙浙江省疾病预防控制中心杭州310051

目的建立液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)-内标法测定尿液中河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的分析方法。方法样品中的TTX经乙酸/甲醇/乙腈(0.005 mL/0.8 mL/1.8 mL)混合溶剂提取,阳离子交换固相萃取(solid phase extraction,SPE)小柱净化,采用含0.3%盐酸的50%乙腈/水洗脱、氨水中和后用XBridgeTMBEH Amide柱(150 mm×3.0 mm,1.7μm)分离,MS/MS测定。通过优化样品提取和SPE净化条件,解决阳离子交换SPE小柱净化尿液基质中TTX回收率偏低、质谱检测基质抑制效应强的难题。结果以春雷霉素为内标定量测定,TTX在0.2~200μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)0.997,样品基质和纯溶剂中TTX线性相关方程的斜率比为0.95;尿液中TTX检出限和定量限分别为0.1和0.2μg/L;三水平加标(0.2、10.0和200μg/L)平均回收率为89.3%~95.3%,相对标准偏差≤5.1%(n=6)。11例中毒患者尿样中TTX含量为0.4~138μg/L;中毒3天以内获得的尿液中TTX的检出率为100%。结论该方法操作简单、准确、灵敏度高,可以为TTX中毒事件快速处置和毒素体内代谢研究提供可靠的技术支撑。

关键词：液相色谱-串联质谱法固相萃取河豚毒素尿液食物中毒

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液相色谱质谱联用测定中毒样品中河豚毒素

食品安全导刊 2022年第24期 101-105页

作者：高榕冬孙磊龙章敏敏彭骢揭阳市疾病预防控制中心广东揭阳522000

建立血液、尿液、胃液以及鱼样中河豚毒素的液相色谱质谱联用测定方法。鱼样基质样品采用1%甲酸甲醇溶液去蛋白,上清液采用固相萃取法去除杂质,血液、胃液用乙腈提取,尿液静置沉淀,并均采用液相色谱质谱联用仪进行河豚毒素测定。实验结... 详细信息

建立血液、尿液、胃液以及鱼样中河豚毒素的液相色谱质谱联用测定方法。鱼样基质样品采用1%甲酸甲醇溶液去蛋白,上清液采用固相萃取法去除杂质,血液、胃液用乙腈提取,尿液静置沉淀,并均采用液相色谱质谱联用仪进行河豚毒素测定。实验结果表明,在线性范围内河豚毒素含量和峰面积具有良好的线性关系。本文所提出的测定中毒样品中河豚毒素的方法具有快速、高效、准确等优点,能够为河豚毒素中毒临床诊断、食品安全检测提供技术保障。

关键词：河豚毒素液相色谱质谱联用固相萃取

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河豚毒素诱导的培养神经元网络的稳态可塑性

河豚毒素诱导的培养神经元网络的稳态可塑性

作者：刘曼华中科技大学

学位级别：硕士

神经可塑性在神经系统发育及功能维持中发挥着重要作用,一直都是研究的热点。稳态可塑性是中枢神经系统中最主要的可塑性机制之一,是脑功能稳定的基础。目前对稳态可塑性的研究中,多采用单细胞水平的膜片钳电生理技术、形态学研究、受... 详细信息

神经可塑性在神经系统发育及功能维持中发挥着重要作用,一直都是研究的热点。稳态可塑性是中枢神经系统中最主要的可塑性机制之一,是脑功能稳定的基础。目前对稳态可塑性的研究中,多采用单细胞水平的膜片钳电生理技术、形态学研究、受体蛋白表达及荧光染色技术等。本文利用多电极阵列系统(multi-electrode array, MEA),实现了神经元网络的体外长期培养,并在网络水平上对稳态可塑性进行了初步探讨。在实验室已有的基础上,改进了神经元细胞的培养方法,使得体外培养的海马神经元网络存活5个月以上。利用MEA系统检测神经元网络的自发电活动,并进行了药理学分析。结果显示,网络活动存在单个锋电位发放模式、高频发放模式、同步簇发放电模式及复杂的锋电位与同步簇发混杂模式等;被1μM河豚毒素完全阻断。通过MEA系统实时检测,选择河豚毒素合适的作用条件,研究了河豚毒素对海马神经元网络活动的作用。结果显示,1μM河豚毒素诱导网络活动完全消失,作用4 h洗脱后,放电频率提高到对照组水平的334.8±32.8%,放电模式由随机单个锋电位发放转换为同步簇发的振荡模式,网络内不同位点间相关性增强;洗脱后随时间的延长,约6 h后增强的网络活动频率恢复到对照组水平,活动模式转变为单个锋电位发放模式。结果表明,体外培养的海马神经元网络具有多种活动模式,多电极阵列系统记录的自发活动来源于钠通道介导的电流。且具有河豚毒素诱导的稳态可塑性。洗脱河豚毒素后网络活动频率的升高与恢复、同步簇发振荡的出现与消失过程显示了体外培养的海马神经元网络稳态可塑性的表现形式与在体、单细胞水平明显不同,其机制更为复杂。

关键词：海马神经元网络可塑性稳态同步振荡河豚毒素多电极阵列

直接稀释结合UPLC-MS/MS同时测定闽东地区贝类中河豚毒素和微囊藻毒素

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福建农业科技 2022年第9期53卷 30-36页

作者：黄连琴宁德市产品质量检验所福建宁德352100

建立了直接稀释结合超高效液相色谱(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)同时测定闽东地区贝类中河豚毒素(Tetradotoxin,TXT)和微囊藻毒素(Microcystin-leucine arginine,MC-LR)含量的分析确证方法。贝类中的TTX和MC-LR用1%乙酸90%甲醇水溶液提取,0.5%乙酸甲醇稀释后,TTX与MC-LR分别用亲水色谱柱Acquity HILIC和Shim-pack GIST C18-AQ HP反相色谱柱分离,乙腈0.1%甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱,UPLC-MS/MS分析,基质匹配标准曲线外标法定量。TTX和MC-LR的方法检出限分别为10μg·kg^(-1)和5μg·kg^(-1),定量限分别为30μg·kg^(-1)和15μg·kg^(-1)。两种毒素的标准添加水平为50、100、500μg·kg^(-1)(鲜重计),回收率范围分别为84.0%~97.6%和85.5%~92.2%,相对标准偏差(RSD,n=6)分别为5.3%~10.0%和6.9%~7.6%。该方法准确、可靠,适用于闽东地区贝类中河豚毒素与微囊藻毒素的同时测定。

关键词：直接稀释 UPLC-MS/MS 河豚毒素微囊藻毒素贝类