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细胞培育肉种子细胞永生化诱导研究

中国食品学报 2022年第12期22卷 52-62页

作者：杨峰李莹莹王守伟刘文婷李石磊中国肉类食品综合研究中心北京食品科学研究院北京100068

目的:构建永生化种子细胞是解决细胞培育肉种子细胞来源高效、可持续的有效手段。方法:基于猪成肌细胞,通过端粒酶逆转录酶进行诱导载体的构建,核转染到细胞后分别通过免疫荧光标记、定量PCR、染色体核型分析等方法进行细胞诱导验证。结... 详细信息

目的:构建永生化种子细胞是解决细胞培育肉种子细胞来源高效、可持续的有效手段。方法:基于猪成肌细胞,通过端粒酶逆转录酶进行诱导载体的构建,核转染到细胞后分别通过免疫荧光标记、定量PCR、染色体核型分析等方法进行细胞诱导验证。结果:构建永生化细胞诱导载体序列完整度高、无突变;成功将载体转入细胞高效表达并获得诱导阳性细胞株1个;转染后染色体核型未发生不可控的突变;同时诱导后的细胞端粒酶逆转录酶表达量显著高于对照组;更重要的是诱导阳性细胞传代次数突破“Hayflick”增殖界限,实现了200以上的传代次数。结论:构建了猪成肌细胞永生化诱导载体,鉴定了细胞诱导后的稳定性,该永生化种子细胞将在细胞培育肉生产中具有广泛的应用前景。

关键词：细胞培育肉种子细胞永生化诱导载体端粒酶逆转录酶

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永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立与鉴定

永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立与鉴定

作者：凌芳石河子大学

学位级别：硕士

胚胎的成功植入是保证妊娠的关键,当一个游离的成熟胚泡附着在子宫内膜上,侵入间质并形成胎盘时,胚胎附植就完成了。为了使这一过程顺利完成,子宫内膜必须处于接受状态。存在于子宫内膜中的部分细胞因子,以自分泌或旁分泌的方式调节子... 详细信息

胚胎的成功植入是保证妊娠的关键,当一个游离的成熟胚泡附着在子宫内膜上,侵入间质并形成胎盘时,胚胎附植就完成了。为了使这一过程顺利完成,子宫内膜必须处于接受状态。存在于子宫内膜中的部分细胞因子,以自分泌或旁分泌的方式调节子宫内膜细胞的分化和囊胚植入。因此体外研究子宫内膜细胞对揭示胚胎附植过程机理具有重要意义。体外培养的原代细胞传代次数有限,细胞会老化丧失活力而导致生理功能变异,不利于长期研究。目的:建立永生化子宫内膜细胞系,为研究绵羊胚胎附植过程中子宫内膜细胞的相关生物学功能奠定基础。方法:(1)本研究采用组织块培养法结合胰酶差时消化法分离获得高纯度绵羊子宫内膜上皮细胞(EECs),免疫荧光法对特异性表达蛋白角蛋白18(CK18)进行鉴定。(2)通过脂质体转染法将p CI-neo-h TERT质粒导入原代上皮细胞中,对转染细胞进行免疫组化和免疫荧光鉴定,CCK8测定生长曲线以及流式细胞仪细胞凋亡检测,Western blot检测h TERT蛋白表达情况。(3)IFN-τ处理绵羊子宫内膜上皮细胞系24 h,通过实时荧光定量PCR技术,检测促孕体延长相关基因ISG15、RSAD2、CTSL、CXCL10,前列腺素代谢相关基因PLA2G4A、SLCO2A1、PTGS2以及脂代谢相关基因FABP4、SLC27A1和PPARG的表达。结果:(1)用组织块培养法第3 d开始有细胞从组织块中爬出,5～6 d单层细胞铺开,倒置显微镜下观察细胞形态呈梭形和铺路石状,上皮和基质两种细胞交织在一起生长。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞时,基质细胞约1 min 30 s变圆有脱落,而上皮细胞则需要6 min变圆有脱落。利用差时消化,成功获得了绵羊子宫内膜上皮细胞。免疫荧光鉴定结果显示上皮细胞呈角蛋白阳性,波形蛋白阴性,阳性率为95%;基质细胞呈波形蛋白阳性,角蛋白阴性,阳性率为95%。(2)用hTERT转染原代EECs,使用500μg/m L浓度的G418筛选转染细胞,14 d后获得阳性克隆停止筛选,扩大培养并命名为h TERT-EECs。免疫荧光结果显示h TERT-EECs表达CK18,免疫组化结果显示第20代h TERT-EECs与第5代原代EECs细胞形态相似,而第10代原代EECs细胞间隙增大,有细胞生长停滞趋向。CCK8测定生长曲线和流式细胞仪细胞凋亡检测结果显示h TERT-EECs生长情况优于原代EECs。Western blot结果显示h TERT-EECs中h TERT蛋白表达且高于原代细胞。(3)研究发现10 ng/m L的IFN-τ处理可以显著增加ISG15转录水平的表达差异最为显著,对比0 ng/m L处理组,10 ng/m L的IFN-τ处理后促孕体延长相关基因RSAD2、CTSL和CXCL10的表达显著上升,前列腺素代谢相关基因SLCO2A1和PTGS2的表达显著上升,而PLA2G4A的表达为显著下降,脂代谢及其他相关基因FABP4的表达无显著变化,SLC27A1和PPARG的表达则有显著上升。结论:本研究通过导入外源基因h TERT,获得了保留了正常原代细胞的生物学特性的永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系,且以此为基础对IFN-τ在绵羊胚胎附植过程中细胞粘附和子宫内膜重塑进行了研究。

关键词：绵羊子宫内膜上皮细胞永生化 hTERT IFN-τ

动物细胞培育肉及其种子细胞优选与永生化策略

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中国生物工程杂志 2024年第5期44卷 56-65页

作者：仝西魁付云辉郑文云王阳敏马兴元华东理工大学生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室上海200237 华东理工大学药学院、上海市新药设计重点实验室上海200237

鉴于传统养殖和屠宰获取肉类食品的方式,环境污染、资源浪费和多种有害成分残留等方面问题不断加剧,以及未来绿色低碳发展所面临的现实问题,随着“细胞农牧”科技的兴起,国内外研究者和企业家将目光转向了具有综合优势的细胞培育肉生产... 详细信息

鉴于传统养殖和屠宰获取肉类食品的方式,环境污染、资源浪费和多种有害成分残留等方面问题不断加剧,以及未来绿色低碳发展所面临的现实问题,随着“细胞农牧”科技的兴起,国内外研究者和企业家将目光转向了具有综合优势的细胞培育肉生产新模式。与以多种蛋白质资源为原料进行调制加工的“植物人造肉”不同,动物细胞培育所生产细胞培育肉,在营养品质和口感上更接近“真肉”,有望成为细胞合成生物技术生产替代蛋白质的未来发展新热点,已成为新兴食品科技和产业与投资界的新宠。将细胞培育成具有一定规模和效率的“培育肉”,将对生长效率与周期,以及规模化生产的成本控制具有基础性作用,其中最为关键的是种子细胞及其永生化扩增能力。主要就国内外有关动物细胞培育肉概况、种子细胞优选与实现其永生化策略,以及动物细胞培育肉方面科技伦理等进行较为系统的综述和分析,为我国开展相关研究和细胞培育肉产业提供重要参考。

关键词：动物细胞培育肉种子细胞优选干细胞永生化人造肉科技伦理

树鼩角膜基质永生化细胞系的构建及其在病毒感染性方面的研究

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中国实验动物学报 2024年第5期32卷 610-619页

作者：丁相荣陈柳霍姝汭杞梦迪刘欣王文广李娜代解杰陆彩霞中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 金华市中心医院浙江金华321099 昆明医科大学昆明650500

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学... 详细信息

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学观察并与40代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定。用单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8株)在该细胞上进行病毒感染实验。结果传至50代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与40代相比仍较好。vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性。增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4~5天时处于对数生长期。原代细胞核型的染色体数稳定为62条,而永生化细胞第21、56代突变为64条且保持稳定。病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104CCID50/mL。结论成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究。

关键词：树鼩角膜基质细胞永生化病毒扩增

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永生化人甲状旁腺细胞系的建立及功能鉴定

中国血液净化 2023年第5期22卷 359-363页

作者：蒋楠李博厚邓淑婷袁也吴琼温似春陈柏锡赵泽文彭思琪夏郁彬陶一鸣刘双信华南理工大学医学院广州510006 南方医科大学附属广东省人民医院(广东省医学科学院)肾内科广州510080

目的建立永生化的人甲状旁腺细胞系并进行功能鉴定。方法采用慢病毒感染的方式将SV40(simian vacuolating virus 40,SV40)大T抗原导入细胞,转染后用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。通过细胞形态学、实时荧光定量聚合酶链式反应(real tim... 详细信息

目的建立永生化的人甲状旁腺细胞系并进行功能鉴定。方法采用慢病毒感染的方式将SV40(simian vacuolating virus 40,SV40)大T抗原导入细胞,转染后用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。通过细胞形态学、实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及免疫荧光检测转染后传代甲状旁腺细胞表达甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、钙敏感受体(calcium sensitive receptor,CaSR)和神经胶质细胞缺失因子2(glial cells missing homolog 2,GCM2)mRNA及蛋白的表达情况。通过细胞增殖实验检测转染的细胞对Ca~(2+)的反应性。结果转染成功的甲状旁腺细胞传代后大部分呈梭形,细胞核椭圆形,胞浆均质透明;RT-qPCR结果显示甲状旁腺细胞表达CaSR、GCM2以及PTH mRNA;免疫荧光显示永生化的甲状旁腺细胞系表达甲状旁腺相关蛋白CaSR、GCM2以及PTH。细胞增殖实验显示低钙能够促进甲状旁腺细胞系增殖。结论本研究成功建立了永生化的甲状旁腺细胞系,为进一步探讨继发性甲状旁腺功能亢进的发病机制及治疗提供了实验基础。

关键词：继发性甲状旁腺功能亢进甲状旁腺细胞永生化

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永生化尼罗罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定

水产学报 2018年第3期42卷 376-387页

作者：张永德潘传燕余艳玲冯鹏霏罗洪林广西水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室

为获得具有单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系,本研究从尼罗罗非鱼腹腔中分离纯化巨噬细胞,采用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染,筛选单克隆细胞的方法建立了尼罗罗非鱼巨噬细胞系,并对其进行了EBV感染鉴定、电镜观... 详细信息

为获得具有单一克隆特性的能稳定传代培养的罗非鱼巨噬细胞系,本研究从尼罗罗非鱼腹腔中分离纯化巨噬细胞,采用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染,筛选单克隆细胞的方法建立了尼罗罗非鱼巨噬细胞系,并对其进行了EBV感染鉴定、电镜观察、端粒酶活性检测、致癌性评估、核型分析以及分子生物学鉴定。研究表明,EBV已整合到尼罗罗非鱼巨噬细胞中且稳定表达,经30代稳定传代,该细胞系仍维持较好的增殖状态;该细胞系表面不平滑,有明显的钝圆形突起和细长的伪足,表现为典型的巨噬细胞形态;端粒酶活性显著高于未经感染的巨噬细胞,而与He La细胞差异不显著,且该细胞系不具有致癌性,说明永生化细胞系构建成功。核型分析结果发现,该细胞系具有44条染色体,其核型公式为2 n=2 x=44=4 sm+17 st+1 t。PCR检测发现,该细胞系存在CD33和CD205的转录本,这些都是单核巨噬细胞的标志物,经18S r RNA检测证明该细胞系来自尼罗罗非鱼巨噬细胞。永生化尼罗罗非鱼巨噬细胞系已被成功建立,该细胞系为研究罗非鱼链球菌HSP70-肽疫苗的高保护率,以及罗非鱼的免疫防御机制提供了工具。

关键词：尼罗罗非鱼巨噬细胞永生化细胞系

永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析

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畜牧兽医学报 2019年第9期50卷 1624-1633页

作者：宋慧子栾兆进王兆琛杜炜赵勇超张家新内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免... 详细信息

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。

关键词：绵羊附睾上皮细胞永生化 hTERT 基因表达

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永生化麝鼠香腺成纤维细胞的转录组学分析

四川农业大学学报 2021年第6期39卷 772-777页

作者：竭航赵春容谌颖莲赵贵军张承露封孝兰曾德军重庆市药物种植研究所/特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室重庆408435 陆军军医大学重庆400038

【目的】探索永生化对麝鼠香腺成纤维细胞转录组的影响。【方法】在获得永生化的麝鼠香腺成纤维细胞后,采用二代测序的方法对其永生化前后转录组进行检测,并通过生物信息学方法进行差异分析。【结果】用Trinity软件对麝鼠永生化和原代... 详细信息

【目的】探索永生化对麝鼠香腺成纤维细胞转录组的影响。【方法】在获得永生化的麝鼠香腺成纤维细胞后,采用二代测序的方法对其永生化前后转录组进行检测,并通过生物信息学方法进行差异分析。【结果】用Trinity软件对麝鼠永生化和原代香腺细胞测序数据进行基因组装,总共发现62 152 unigenes,富集分析结果显示,上述基因主要聚集在细胞代谢、细胞生物学调控、蛋白结合和酶催化等基因的细胞基础代谢活动。基于DESeq2包的基因表达差异分析结果表明,永生化和原代细胞表达差异的基因总共有8 690个,其中上调基因3 414个,下调基因5 276个,上调基因主要富集于DNA复制、同源重组、错配修复、细胞周期和RNA代谢通路,下调基因主要富集于氧化磷酸化、帕金森病和阿尔茨海默病疾病通路中。【结论】永生化过程对麝鼠原代细胞基因的影响较大,可为后续建立永生化香腺细胞体外泌香体系提供理论支撑。

关键词：麝鼠香腺细胞永生化转录组

树鼩脑微血管内皮永生化细胞系的建立及最适D-半乳糖浓度诱导BMECs衰老细胞模型的探讨

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中国实验动物学报 2023年第3期31卷 337-345页

作者：陈柳邱敏丁相荣霍姝汭王文广陆彩霞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 昆明医科大学昆明650500

目的建立树鼩永生化脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),明确D-半乳糖对BMECs衰老的影响,探索其潜在机制。方法用携带SV40T基因的慢病毒转染BMECs,传至50代后进行形态观察、生长曲线测定以及免疫荧光和核... 详细信息

目的建立树鼩永生化脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),明确D-半乳糖对BMECs衰老的影响,探索其潜在机制。方法用携带SV40T基因的慢病毒转染BMECs,传至50代后进行形态观察、生长曲线测定以及免疫荧光和核型鉴定;再用不同浓度D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导BMECs,通过细胞增殖实验确定最适诱导条件,用衰老相关β半乳糖苷酶染色分析细胞衰老情况,Western Blot检测衰老相关蛋白p53的表达水平,超氧化物歧化酶和脂质氧化检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平。结果永生化的细胞生长状态较好,不同代次的细胞形态一致,单个细胞呈短梭形或多角形,整体呈典型的铺路石状;细胞生长曲线显示细胞数量在第2~5天时处于对数生长期,在第6天时达到高峰,之后缓慢增长进入平台期;免疫荧光显示该细胞特异蛋白vWF和CD31及永生化基因SV40T为阳性;细胞核型结果显示永生化细胞染色体数目与滇西亚种树鼩的染色体数量相符;D-gal诱导BMECs抑制细胞增殖,有时间和浓度依赖性;实验组,即浓度为10 g/L的D-gal诱导48 h的BMECs,β-半乳糖苷酶染色阳性明显增多、衰老相关蛋白p53显著增多、细胞内SOD酶活性降低和MDA含量增多。结论成功构建树鼩永生化脑微血管内皮细胞系,10 g/L的D-gal是建立永生化BMECs衰老模型的适合浓度,D-gal在体外促进细胞衰老可能是通过促进氧化应激水平、抑制细胞增殖来实现的。

关键词：树鼩脑微血管内皮细胞永生化 D-半乳糖衰老模型