永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系的建立与鉴定

作     者：凌芳 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡广东;王静

授予年度：2022年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：绵羊 子宫内膜上皮细胞 永生化 hTERT IFN-τ 

摘      要：胚胎的成功植入是保证妊娠的关键,当一个游离的成熟胚泡附着在子宫内膜上,侵入间质并形成胎盘时,胚胎附植就完成了。为了使这一过程顺利完成,子宫内膜必须处于接受状态。存在于子宫内膜中的部分细胞因子,以自分泌或旁分泌的方式调节子宫内膜细胞的分化和囊胚植入。因此体外研究子宫内膜细胞对揭示胚胎附植过程机理具有重要意义。体外培养的原代细胞传代次数有限,细胞会老化丧失活力而导致生理功能变异,不利于长期研究。目的:建立永生化子宫内膜细胞系,为研究绵羊胚胎附植过程中子宫内膜细胞的相关生物学功能奠定基础。方法:(1)本研究采用组织块培养法结合胰酶差时消化法分离获得高纯度绵羊子宫内膜上皮细胞(EECs),免疫荧光法对特异性表达蛋白角蛋白18(CK18)进行鉴定。(2)通过脂质体转染法将p CI-neo-h TERT质粒导入原代上皮细胞中,对转染细胞进行免疫组化和免疫荧光鉴定,CCK8测定生长曲线以及流式细胞仪细胞凋亡检测,Western blot检测h TERT蛋白表达情况。(3)IFN-τ处理绵羊子宫内膜上皮细胞系24 h,通过实时荧光定量PCR技术,检测促孕体延长相关基因ISG15、RSAD2、CTSL、CXCL10,前列腺素代谢相关基因PLA2G4A、SLCO2A1、PTGS2以及脂代谢相关基因FABP4、SLC27A1和PPARG的表达。结果:(1)用组织块培养法第3 d开始有细胞从组织块中爬出,5～6 d单层细胞铺开,倒置显微镜下观察细胞形态呈梭形和铺路石状,上皮和基质两种细胞交织在一起生长。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞时,基质细胞约1 min 30 s变圆有脱落,而上皮细胞则需要6 min变圆有脱落。利用差时消化,成功获得了绵羊子宫内膜上皮细胞。免疫荧光鉴定结果显示上皮细胞呈角蛋白阳性,波形蛋白阴性,阳性率为95%;基质细胞呈波形蛋白阳性,角蛋白阴性,阳性率为95%。(2)用hTERT转染原代EECs,使用500μg/m L浓度的G418筛选转染细胞,14 d后获得阳性克隆停止筛选,扩大培养并命名为h TERT-EECs。免疫荧光结果显示h TERT-EECs表达CK18,免疫组化结果显示第20代h TERT-EECs与第5代原代EECs细胞形态相似,而第10代原代EECs细胞间隙增大,有细胞生长停滞趋向。CCK8测定生长曲线和流式细胞仪细胞凋亡检测结果显示h TERT-EECs生长情况优于原代EECs。Western blot结果显示h TERT-EECs中h TERT蛋白表达且高于原代细胞。(3)研究发现10 ng/m L的IFN-τ处理可以显著增加ISG15转录水平的表达差异最为显著,对比0 ng/m L处理组,10 ng/m L的IFN-τ处理后促孕体延长相关基因RSAD2、CTSL和CXCL10的表达显著上升,前列腺素代谢相关基因SLCO2A1和PTGS2的表达显著上升,而PLA2G4A的表达为显著下降,脂代谢及其他相关基因FABP4的表达无显著变化,SLC27A1和PPARG的表达则有显著上升。结论:本研究通过导入外源基因h TERT,获得了保留了正常原代细胞的生物学特性的永生化绵羊子宫内膜上皮细胞系,且以此为基础对IFN-τ在绵羊胚胎附植过程中细胞粘附和子宫内膜重塑进行了研究。