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双作用靶点水蛭素ⅲ突变体库(R_(33)G_(34)D_(35)X_(36-r)HV3)的构建及最适突变体筛选

药物生物技术 2011年第3期18卷 195-200页

作者：许静王航谭树华中国药科大学生命科学与技术学院分子生物学教研室江苏南京210009

构建水蛭素ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ,从中筛选出具有与重组水蛭素ⅲ(rHV3)抗凝血酶活性比活力相当,同时又具有很强的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素ⅲ突变体。通过基因定点突变技术构建水蛭素ⅲ突变库R33G34... 详细信息

构建水蛭素ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ,从中筛选出具有与重组水蛭素ⅲ(rHV3)抗凝血酶活性比活力相当,同时又具有很强的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素ⅲ突变体。通过基因定点突变技术构建水蛭素ⅲ突变库R33G34D35X36-rHVⅢ,表达纯化后通过凝血酶滴定方法测定其抗凝血酶比活性,同时测定其抗ADP诱导的血小板聚集比活性。结果显示所有突变体的抗凝血酶比活性未发生变化,但各突变体抗ADP诱导的血小板聚集的比活性各异,当第36位为Met和Ser时所表现的抗ADP诱导的血小板聚集的比活性最强。由此可知水蛭素ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ中第36位氨基酸种类对其抗凝血酶活性影响不大,但对其抗ADP诱导的血小板聚集的比活性影响较大,当该位点为Met和Ser时突变体具有很好的抗凝血酶和抗ADP诱导的血小板聚集的双重药理活性。

关键词：水蛭素ⅲ 定点突变抗血小板聚集 RGD序列

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重组水蛭素ⅲ的工程菌的培养及高密度发酵

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药物生物技术 2004年第1期11卷 22-24页

作者：崔莉谭树华吴梧桐中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009

为提高重组水蛭素ⅲ工程菌的产水蛭素量 ,采用正交实验法确定了较佳培养基组分 ,优化了摇瓶发酵工艺和发酵条件 ,工程菌摇瓶水蛭素产量稳定在 2 0 0 0ATU/ml左右 ,30L发酵罐批式发酵水蛭素产量达到4 0 0 0ATU/ml,补料 -批式发酵水蛭素... 详细信息

为提高重组水蛭素ⅲ工程菌的产水蛭素量 ,采用正交实验法确定了较佳培养基组分 ,优化了摇瓶发酵工艺和发酵条件 ,工程菌摇瓶水蛭素产量稳定在 2 0 0 0ATU/ml左右 ,30L发酵罐批式发酵水蛭素产量达到4 0 0 0ATU/ml,补料 -批式发酵水蛭素产量达到 80 0 0ATU/ml。

关键词：水蛭素ⅲ 大肠杆菌发酵

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在大肠杆菌中信号肽介导水蛭素ⅲ分泌表达研究

在大肠杆菌中信号肽介导水蛭素Ⅲ分泌表达研究

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第四届中国新医药博士论坛

作者：谭树华吴梧桐刘景晶濮颖辉中国药科大学生物制药教研室

设计合成了两对(四条)寡核苷酸链,将之退火、拼连成一种新型***信号肽简并基因,同时利用密码子的简并生在该基因3’端基因内引入一个NheI限制酶切位点。此外,用PCR技术在水蛭素ⅲ基因5’端引入NheI限制酶切位点,利用该酶切位点将信号肽... 详细信息

设计合成了两对(四条)寡核苷酸链,将之退火、拼连成一种新型***信号肽简并基因,同时利用密码子的简并生在该基因3’端基因内引入一个NheI限制酶切位点。此外,用PCR技术在水蛭素ⅲ基因5’端引入NheI限制酶切位点,利用该酶切位点将信号肽基因与水蛭素ⅲ基因进行连接且保持原有阅读框架不变,构建了重组质粒pUCSH,测序结果表明,融合基因核苷酸序列与设计要求完全一致,将该融合基因插入表达载体pTA中构建成水蛭素ⅲ分泌表达质粒pTASH,该质粒在大肠杆菌中表达后,表达产物有效分泌至细胞外培养基中,抗凝血酶生物活性达350ATU/ml培养液以上。

关键词：水蛭素ⅲ 信号肽序列分泌表达

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在大肠杆菌中分泌表达水蛭素ⅲ基因的初步研究

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中国药科大学学报 1999年第1期 25-25页

作者：谭树华吴梧桐刘景晶

为实现水蛭素ⅲ（ＨＶ３）基因的分泌表达，设计合成了两对（四条）寡核苷酸链，退火、拼连成Ｌ门冬酰胺酶信号肽简并基因，同时利用密码子的简并性在该基因３′端基因内引入了一个ＮｈｅⅠ限制酶切位点。此外，用ＰＣＲ技术在ＨＶ３... 详细信息

为实现水蛭素ⅲ（ＨＶ３）基因的分泌表达，设计合成了两对（四条）寡核苷酸链，退火、拼连成Ｌ门冬酰胺酶信号肽简并基因，同时利用密码子的简并性在该基因３′端基因内引入了一个ＮｈｅⅠ限制酶切位点。此外，用ＰＣＲ技术在ＨＶ３基因５′端引入ＮｈｅⅠ限制酶切位点，利用该酶切位点将信号肽基因与ＨＶ３基因进行连接且保护原有阅读框架不变，构建了重组质粒ｐＵＣＳＨ，测序结果表明，融合基因核苷酸序列与设计要求完全一致，将该融合基因插入ｐＫＫ２３３２中构建成ＨＶ３分泌表达质粒ｐＫＳＨ，该质粒在大肠杆菌中表达后，表达产物分泌至细胞膜间质中，膜间质蛋白抽提液抗凝血酶生物活性为１０１４ＡＴＵ／ｍｌ培养液。

关键词：限制酶切位点大肠杆菌大肠埃希氏菌埃希氏杆菌属基因分泌表达水蛭素ⅲ

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新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素ⅲ基因研究

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中国生化药物杂志 1999年第1期20卷 10-12页

作者：谭树华吴梧桐刘景晶中国药科大学生物制药教研室南京210009

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体，将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入ｐＫＡ质粒的ＡＳＰｓⅡ编码基因ａｎｓＢ中，使ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基... 详细信息

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体，将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入ｐＫＡ质粒的ＡＳＰｓⅡ编码基因ａｎｓＢ中，使ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与ＨＶ３形成融合蛋白，从而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒ｐＫＡＨ，通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成ｐＵＣ高拷贝数复制原点，进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌ＪＭ１０５宿主细胞中表达后，融合蛋白（１５．６ｋＤ）占细菌总蛋白１０５％，该融合蛋白经ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子，抗凝血活力达约２０ＡＴＵ／ｍｌ培养液，为以后进一步研究打下了基础。

关键词：融合表达水蛭素ⅲ 大肠杆菌

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