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miR-23a靶向CELF1调控水牛颗粒细胞凋亡的研究

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miR-23a靶向CELF1调控水牛颗粒细胞凋亡的研究

作者：汪浩鑫广西大学

学位级别：硕士

本研究根据课题组前期对水牛GV/MII期卵母细胞对应卵丘细胞的micro RNA（miRNA）高通量测序结果,在MII期卵丘细胞显著上调的24条差异表达miRNAs中选择了一条可能与颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）凋亡相关的miR-23a进行研究。初步探讨... 详细信息

本研究根据课题组前期对水牛GV/MII期卵母细胞对应卵丘细胞的micro RNA（miRNA）高通量测序结果,在MII期卵丘细胞显著上调的24条差异表达miRNAs中选择了一条可能与颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）凋亡相关的miR-23a进行研究。初步探讨了miR-23a及其靶基因对水牛GCs体外培养过程中细胞凋亡的调控作用及其分子机制,为提高水牛卵母细胞体外成熟效率提供理论基础。研究取得如下主要结果:1.miR-23a预测靶基因CELF1的筛选及靶向关系验证。本研究对miR-23a预测的1237个靶基因进行GO富集和KEGG分析,发现靶基因主要参与核糖体等信号通路,这些通路主要集中在对细胞的增殖、凋亡、物质代谢等调控,并筛选出关键靶基因CELF1。RT-q PCR分析miR-23a在水牛不同组织的表达情况,结果发现miR-23a在卵巢中高表达,在睾丸和附睾中微表达。为进一步验证miR-23a与CELF1的靶向关系,RT-q PCR检测结果发现水牛GCs中添加miR-23a mimic显著降低GCs中CELF1的m RNA表达（P＜0.05）;进而双荧光素酶试验亦证明miR-23a与CELF1存在靶向关系。2.探讨了miR-23a靶向CELF1对水牛颗粒细胞凋亡的影响。为了研究miR-23a对水牛GCs凋亡和增殖的影响,在体外培养的水牛GCs中添加miR-23a mimic/inhibitor,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况,结果发现miR-23a mimic能显著促进水牛GCs的凋亡（P＜0.05）;Ed U染色结果显示,miR-23a mimic抑制细胞的增殖（P＜0.05）,而miR-23a inhibitor则相反。其次,构建了pc-DNA3.1-CELF1过表达载体,瞬时转染到体外培养的水牛GCs中,结果发现CELF1可以显著促进水牛GCs增殖,抑制细胞凋亡（P＜0.05）,过表达CELF1同miR-23a inhibitor结果一致。而且,通过RT-q PCR、Western blot技术检测细胞凋亡相关基因和蛋白的相对表达量,发现miR-23a mimic促进水牛GCs中凋亡相关基因BAX、caspase3和P53的m RNA和蛋白表达,抑制抗凋亡基因Bcl2 m RNA和蛋白表达;而CELF1同miR-23a mimic结果相反。进而将miR-23a和CELF1共同转入水牛GCs时,结果发现CELF1可逆转miR-23a对水牛GCs凋亡的作用。ELISA试验检测miR-23a和CELF1对水牛GCs类固醇激素分泌的影响,结果显示,miR-23a mimic使雌二醇（E2）分泌显著下降（P＜0.05）,孕酮（P4）的分泌显著升高（P＜0.05）;过表达CELF1的结果和miR-23a mimic相反;而miR-23a和CELF1共转后CELF1可逆转miR-23a对GCs分泌E2的抑制作用。此外,采用RT-q PCR检测PI3K/AKT通路相关基因表达的变化,以进一步验证miR-23a通过靶向CELF1调控细胞凋亡的分子机理,结果显示,miR-23a下调PI3K（P＜0.05）和AKT（P＞0.05）的基因表达,上调通路基因PTEN的表达（P＜0.05）;miR-23a和CELF1共转后可以解除miR-23a对PI3K和AKT基因的抑制表达作用（P＜0.05）,抑制miR-23a对PTEN基因的促进表达作用（P＜0.05）。以上结果表明:（1）miR-23a在水牛卵巢中高表达,miR-23a与CELF1存在靶向关系;（2）miR-23a促进体外培养的水牛GCs凋亡,降低E2分泌而促进P4的分泌;相反,CELF1促进体外培养的水牛GCs增殖,提高E2分泌但降低P4的分泌;miR-23a通过靶向CELF1能够降低水牛GCs凋亡、促进细胞增殖和E2激素分泌;（3）miR-23a靶向CELF1可能通过抑制细胞中PI3K/AKT信号通路进而调控水牛GCs的凋亡。

关键词：水牛颗粒细胞 miRNA-23a CELF1 细胞凋亡细胞增殖

槲皮素缓解内质网应激诱导的水牛卵泡颗粒细胞凋亡的初步研究

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槲皮素缓解内质网应激诱导的水牛卵泡颗粒细胞凋亡的初步研究

作者：杨潍菡广西大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵巢上有数以千计的卵泡,但在卵泡发育过程中大部分的卵泡都会发生闭锁,影响雌性动物繁殖力,造成优良雌性资源的浪费。颗粒细胞的凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因之一,因此探究颗粒细胞的凋亡对提高雌性动物繁殖力至关重要。内质... 详细信息

哺乳动物卵巢上有数以千计的卵泡,但在卵泡发育过程中大部分的卵泡都会发生闭锁,影响雌性动物繁殖力,造成优良雌性资源的浪费。颗粒细胞的凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因之一,因此探究颗粒细胞的凋亡对提高雌性动物繁殖力至关重要。内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress）可以诱导细胞凋亡,影响细胞正常功能。然而,内质网应激在水牛（Bubalus bubalis）颗粒细胞的凋亡和功能中产生的影响尚不清楚。槲皮素（Quercetin QC）作为一种植物源性的黄酮类化合物,能通过抗氧化、抗炎症等多种生物途径保护细胞。QC能否缓解内质网应激对水牛颗粒细胞造成的影响仍有待探究。因此,本研究以水牛颗粒细胞为研究对象,利用衣霉素（Tunicamycin）构建内质网应激模型,探究内质网应激对水牛颗粒细胞的影响,并通过添加QC探究能否缓解内质网应激对水牛颗粒细胞的影响。本文主要研究内容如下:一、水牛颗粒细胞的分离鉴定与内质网应激模型的构建。通过对水牛卵泡液分离纯化获得水牛颗粒细胞并进行细胞免疫荧光鉴定。结果表明,获取的细胞均检测到FSHR蛋白荧光信号,表明分离得到的细胞均为水牛颗粒细胞。通过添加衣霉素构建水牛颗粒细胞内质网应激模型,使用流式细胞分析检测细胞凋亡率、q RT-PCR和Western Blot检测细胞凋亡及内质网应激相关基因和蛋白的变化。结果表明,使用2.5μg/m L的衣霉素处理颗粒细胞48 h,显著增加了颗粒细胞的凋亡率;q RT-PCR结果分析促凋亡相关基因表达量上调,抗凋亡相关基因表达量下调,内质网应激相关基因的表达量显著上升;Western Blot分析证实蛋白质表达变化与m RNA变化一致。表明成功构建水牛颗粒细胞内质网应激模型。二、槲皮素缓解内质网应激引起的水牛颗粒细胞凋亡。使用2μg/m L的QC预处理颗粒细胞8 h,再构建内质网应激模型,通过流式细胞分析检测颗粒细胞凋亡率,q RT-PCR和Western Blot检测细胞凋亡和内质网应激相关基因和蛋白的变化。结果表明,QC预处理显著降低颗粒细胞凋亡率和细胞内ROS（Reactive Oxygen Species）水平,同时可以显著降低颗粒细胞促凋亡和内质网应激相关基因和蛋白的表达,增加抗凋亡基因和蛋白的的表达。为进一步探究QC缓解内质网应激的作用机制,通过转染pc DNA3.1-CHOP过表达质粒,探究QC对内质网应激的作用机制。结果表明过表达Chop基因后,细胞凋亡率和ROS水平显著增强,QC预处理后显著降低颗粒细胞ROS水平和细胞凋亡率。说明QC预处理可通过调控内质网应激通路缓解对颗粒细胞的影响。三、槲皮素缓解内质网应激对颗粒细胞功能的影响。通过ELISA方法测定颗粒细胞中雌二醇（Estradiol,E2）和孕酮（Progesterone,PG）的含量,发现内质网应激会抑制颗粒细胞中E2和PG的分泌,QC预处理能促进E2和PG的分泌。利用q RT-PCR和Western Blot检测E2和PG合成分泌相关基因和蛋白的表达,结果表明,内质网应激发生后,CYP19A1和HSD3B1基因及蛋白的表达降低,QC预处理后,CYP19A1和HSD3B1基因和蛋白的表达量显著上调。上述结果说明水牛颗粒细胞内质网应激会抑制E2和PG的合成分泌,而QC预处理会显著增加E2和PG的合成分泌。综上所述,本研究在水牛颗粒细胞中成功构建内质网应激模型,阐明了QC通过缓解内质网应激抑制水牛颗粒细胞凋亡、促进类固醇激素分泌,初步探讨了QC缓解内质网应激的作用机制,为利用QC缓解水牛卵泡闭锁,提高雌性水牛繁殖能力提供新的思路。

关键词：槲皮素水牛颗粒细胞内质网应激细胞凋亡类固醇激素

水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达及雌二醇对其表达调控的研究

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水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达及雌二醇对其表达调控的研究

作者：李润广西大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵泡在发育过程中,除少量发育成熟并排卵外,绝大部分发生退化、闭锁。研究表明,卵泡闭锁的主要诱因是颗粒细胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、猪、绵羊和山羊等动物的颗粒细胞凋亡及其调控机理的研究报道,但对水牛卵泡颗粒细胞凋亡... 详细信息

哺乳动物卵泡在发育过程中,除少量发育成熟并排卵外,绝大部分发生退化、闭锁。研究表明,卵泡闭锁的主要诱因是颗粒细胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、猪、绵羊和山羊等动物的颗粒细胞凋亡及其调控机理的研究报道,但对水牛卵泡颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的分子机制研究较少。为此,本试验首先对不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因及miRNA的表达规律进行了分析,以了解颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁的关系,初步阐明水牛卵泡闭锁的分子机制。其次,通过研究雌二醇(E2)对体外培养的水牛颗粒细胞凋亡、细胞周期、凋亡相关基因和miRNA表达的影响,探索E2在调控水牛颗粒细胞凋亡过程中的作用,为优化颗粒细胞体外培养条件以及进一步了解水牛卵泡闭锁机理奠定基础。一、不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。1.采用HE染色、DNA ladder分析和Tunel法检测了HF、EF和PF三种不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞的凋亡状态。结果发现,HF卵泡腔中无脱落的颗粒细胞,其中的颗粒细胞基因组DNA没有出现明显的DNAladder,细胞凋亡率为9.32%。EF卵泡内壁结构较松散,卵泡腔中可见到有少量脱落的颗粒细胞,其颗粒细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,细胞凋亡率为17.24%。PF颗粒细胞大部分脱落于卵泡腔中,卵泡内壁退化严重,基因组DNA降解严重,出现明显的DNA ladder,凋亡率达20.26%。2.利用qRT-PCR方法分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。结果显示,死亡受体通路相关的Fas等基因在HF、 EF、PF三种颗粒细胞中均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深,其表达量显著升高(P颗粒细胞中不表达而在EF和PF中表达,TRAIL基因在三种颗粒细胞中均不表达。所检测的线粒体通路相关基因在三种颗粒细胞中均有表达,其中Bcl-2、Bcl-xl和MCL-1基因在HF颗粒细胞表达最高,随着卵泡闭锁程度加深,其表达量逐渐降低;Bax等基因在PF颗粒细胞表达最高,且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。内质网应激通路相关基因在三种颗粒细胞均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。所检测的包括miR21-5P在内的16条miRNA在HF、EF和PF颗粒细胞均有表达,其中miR21-5P等10条miRNA的表达水平随着卵泡闭锁程度加深呈先升高后下降的趋势;miR99a-5P等6条miRNA的表达量随着卵泡闭锁程度加深而逐渐降低。3.运用免疫组化方法分析了细胞凋亡相关蛋白Fas和Caspase3在不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中的表达。结果显示,Fas和Caspase3蛋白在HF、EF、PF颗粒细胞中均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深其表达水平逐渐增强。二、E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响及其调控机制。1.采用Tunel法分析了E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响。结果发现,浓度为10-5mol/L的E2能够有效抑制颗粒细胞凋亡,且呈现出剂量依赖性;而雌激素受体抑制剂ICI182780能够阻断这一效应。2.采用流式细胞仪分析了E2对水牛颗粒细胞细胞周期的影响。结果显示,单独添加10-5mol/L E2处理颗粒细胞后,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例显著增加,ICI182780单独处理和E2+ICI182780联合处理的样品细胞周期均没有显著变化。3.利用qRT-PCR技术分析了E2对水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达的影响。结果显示,ERβ和Fas等凋亡相关基因及miRNA在不同处理组中均有表达,E2处理后,ERβ和Bcl-2基因表达水平提高,Fas等基因和miR21-5p等miRNA表达降低,其他处理组相关基因和miRNA表达无显著变化。4.采用western-blot方法检测了E2对水牛颗粒细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示,E2处理后Fas、Bax、caspase9蛋白表达量降低,其蛋白质水平分析结果与mRNA水平表达情况一致。其他处理组3个蛋白的表达均无显著变化。以上结果表明,水牛卵泡闭锁过程中有大量颗粒细胞发生凋亡,且随着卵泡闭锁程度加深凋亡率升高。Fas、Bcl-2和ATF4等死亡受体、线粒体和内质网三条凋亡信号通路的相关基因和]miRNA21-5P等部分miRNA均参与了水牛颗粒细胞凋亡的表达调控。E2通过剂量依赖方式有效抑制体外培养的颗粒细胞发生凋亡,同时通过其受体ERβ的介导影响细胞周期、部分凋亡相关基因及miRNA表达的方式来促进颗粒细胞增殖。

关键词：水牛颗粒细胞卵泡闭锁细胞凋亡基因表达 E2 miRNA

AQP9基因在不同闭锁进程水牛卵泡颗粒细胞中的表达及其与细胞凋亡关系的研究

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中国兽医科学 2021年第3期51卷 374-379页

作者：刘晨屈春凤尹桂军任宣石德顺李湘萍广西大学动物科学技术学院广西南宁530004

为了解AQP9基因表达及其与水牛颗粒细胞凋亡的关系,初步阐明它在水牛卵泡闭锁中的作用,首先分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中AQP9基因和凋亡相关基因的表达情况。通过构建颗粒细胞凋亡模型、过表达AQP9基因的方法分析了它对细胞凋... 详细信息

为了解AQP9基因表达及其与水牛颗粒细胞凋亡的关系,初步阐明它在水牛卵泡闭锁中的作用,首先分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中AQP9基因和凋亡相关基因的表达情况。通过构建颗粒细胞凋亡模型、过表达AQP9基因的方法分析了它对细胞凋亡相关基因表达的影响。为进一步了解PKC通路与AQP9基因表达的相关性,添加PKC抑制剂处理水牛颗粒细胞,分析细胞凋亡和基因表达情况。上述研究结果表明,AQP9基因主要参与早期卵泡闭锁的过程,AQP9基因可能通过PKC信号通路调节水牛颗粒细胞的凋亡。

关键词：水通道蛋白9 蛋白激酶抑制剂水牛颗粒细胞细胞凋亡基因表达

褪黑激素对水牛颗粒细胞的调节和生长抑素基因疫苗免疫程序及安全性研究

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褪黑激素对水牛颗粒细胞的调节和生长抑素基因疫苗免疫程序及安全...

作者：种振路华中农业大学

学位级别：硕士

奶水牛和生猪是国家鼓励和优先发展的两大产业。开发提高水牛繁殖力和猪生长速度的新技术,是促进上述两大产业发展的重要举措。为了：①探讨水牛卵泡发育的调节机制,促进水牛繁殖新技术的发展;②优化生长抑素基因免疫程度,分析该疫苗的... 详细信息

奶水牛和生猪是国家鼓励和优先发展的两大产业。开发提高水牛繁殖力和猪生长速度的新技术,是促进上述两大产业发展的重要举措。为了：①探讨水牛卵泡发育的调节机制,促进水牛繁殖新技术的发展;②优化生长抑素基因免疫程度,分析该疫苗的生物安全性,促进该疫苗的推广应用本研究利用。因此本研究从褪黑激素对水牛卵泡颗粒细胞体外调节、生长抑素基因免疫程序优化与安全性评定等角度开展研究,主要内容和结果如下：1.褪黑激素对水牛颗粒细胞的调节及其作用机制研究褪黑激素(MLT)受光信号控制,对生殖系统、特别是卵巢功能具有调节作用。MLT对水牛卵泡发育是否有调节作用,尚不清楚。本实验从颗粒细胞的褪黑激素受体表达、调节及外源MLT对水牛颗粒细胞凋亡、增殖与激素分泌等方面进行了研究,主要内容和结果如下：(1)提取水牛颗粒细胞RNA,经反转录获得细胞cNDA,并成功扩增出MT1受体特异性条带,表明水牛颗粒细胞表达褪黑激素受体。(2)将水牛颗粒细胞用含低(0.1nM)、中(1nM)、高(100nM)剂量MLT的培养液处理24小时,在mRNA水平检测MTl及相关受体的表达情况,结果发现,MT1受体表达在各浓度MLT作用下明显上调,FSH和GnRH受体表达显著下降,LH受体表达在高剂量组显著上调,中、低剂量组无显著变化。(3)用MLT处理水牛颗粒细胞24h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡及增殖情况,发现与对照组相比,高剂量组的细胞凋亡显著减少,中、低剂量组组无明显差异;另外,中、高剂量组细胞增殖明显高于对照组,低剂量组与对照组无显著差异。用Western Blot检测细胞相关调控因子,发现中、高剂量组中bcl2表达显著上调,高剂量组中caspase3、p21和p27表达明显下降,这与流式检测结果一致。测定培养液中雌激素和孕激素浓度,发现高剂量组的孕激素分泌明显减少,而各组的雌激素分泌量变化不明显。2.生长抑素基因疫苗免疫程序及安全性研究本研究选择45日龄杜长大三元杂交猪25头,分成5组,从免疫原(Pcs/2SS)剂量(0.5mg,1.0mg,2.0mg)和免疫方式(电转化和肌肉注射)以及安全性评价等方面着手,比较了各种剂量、两种给药方式的免疫和促生长效果,分析了目的基因整合情况,结果如下：(1)免疫质粒后,实验组猪均有抗体产生,表明疫苗引发了机体的免疫应答。在初次免疫和加强免疫第2周,抗体阳性猪比例最高,加强免疫后体内抗体水平的维持时间与初次免疫相比明显增长。同时,在加强免疫后的第2周生长速度也达到高峰,但各组动物激素内分泌水平与对照组并无差异。(2)试验猪达到出栏体重后屠宰,采集脂肪和肌肉,提取组织DNA,检测质粒整合,结果显示各组均为阴性,说明质粒未整合到动物基因组内,因而认为该疫苗是安全的。

关键词：水牛颗粒细胞周期凋亡褪黑激素受体 Pcs/2SS质粒电转化免疫应答安全性

水牛卵泡颗粒细胞自噬及其调控对细胞增殖的影响研究

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水牛卵泡颗粒细胞自噬及其调控对细胞增殖的影响研究

作者：李卉广西大学

学位级别：硕士

哺乳动物卵泡发育是一个极为复杂且受到精密调控的生理过程。颗粒细胞作为卵泡的一种主要体细胞,在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中起到重要作用,其功能状态决定卵泡的命运。细胞自噬是Ⅱ类程序性细胞死亡,由自噬引起的细胞死亡,可双重调... 详细信息

哺乳动物卵泡发育是一个极为复杂且受到精密调控的生理过程。颗粒细胞作为卵泡的一种主要体细胞,在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中起到重要作用,其功能状态决定卵泡的命运。细胞自噬是Ⅱ类程序性细胞死亡,由自噬引起的细胞死亡,可双重调节细胞的死亡和存活,在一定程度上能扭转细胞凋亡的命运,成为细胞存活的促进性因素。目前有关大鼠等动物卵巢颗粒细胞自噬已有许多研究进展,但对水牛颗粒细胞自噬及其与凋亡的关系研究较少。本研究首先按照不同划分标准对卵泡进行分类,包括卵泡直径大小和卵泡闭锁程度,探究卵泡发育阶段与颗粒细胞自噬和凋亡的关系,分析卵泡颗粒细胞自噬、凋亡相关基因的表达规律。然后,利用雷帕霉素作为mTOR途径的抑制剂调控自噬,研究其对体外培养水牛颗粒细胞自噬、凋亡、生长曲线、细胞周期及相关基因表达的影响,初步探索雷帕霉素调控自噬对细胞生长增殖的作用,为进一步优化水牛颗粒细胞体外培养条件奠定基础。1、不同发育阶段水牛卵泡颗粒细胞自噬及凋亡的分析：采用GFP-LC3转染、Annexin V-FITC/PI双染检测不同大小和不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞的自噬和凋亡状态。结果显示,两种卵泡分类方法试验中,与小卵泡和中卵泡颗粒细胞相比,大卵泡颗粒细胞的自噬率和非活细胞率最高,凋亡率最低;与健康和早期闭锁卵泡颗粒细胞相比,晚期闭锁卵泡颗粒细胞的自噬率和凋亡率较高。运用qRT-PCR方法分析不同大小和不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中Atg3、LC3、BECN1等自噬相关基因和Bcl-2、Bax、P53等凋亡相关基因的表达,结果显示,各基因在不同大小卵泡和不同闭锁程度卵泡颗粒细胞中均有表达。与小和中卵泡中的颗粒细胞相比,Atg3、 Atg5、Atg7、 Atg12、BECN1、LC3自噬相关基因在大卵泡颗粒细胞中的表达显著增加(P颗粒细胞中的表达最高,随着卵泡闭锁呈现出显著升高(P颗粒细胞中表达量最高,随着卵泡闭锁程度的增加,二者的表达量逐渐降低。LC3蛋白在成熟卵泡中的表达比原始卵泡中多,与卵泡发育程度呈正相关。2、调控白噬对体外培养水牛颗粒细胞增殖的影响：首先采用透射电镜对体外培养的水牛颗粒细胞进行形态学观察,发现正常培养条件下多种状态的细胞并存,发生白噬的细胞中可观察到自噬体和自噬溶酶体。其次,添加雷帕霉素处理体外培养的水牛颗粒细胞,与添加10%血清DMEM培养的颗粒细胞相比,发现细胞自噬率和凋亡率均显著升高(P细胞仪分析细胞周期结果显示,雷帕霉素处理后,G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例减少。运用qRT-PCR方法分析雷帕霉素处理后Atg3、Atg5、ULK1等自噬相关基因以及Bcl-2、Bax、P53等凋亡相关基因的表达,发现在0.2nM处理条件下,与添加10%血清DMEM培养的颗粒细胞相比,Atg3、Atg5、ULK1等自噬相关基因表达均有明显升高(P0.05)。以上研究结果表明,生长过程中的水牛卵泡颗粒细胞发生自噬和凋亡,随着卵泡直径的增大以及闭锁程度的加深,颗粒细胞的自噬率和凋亡率逐渐上升;雷帕霉素通过抑制mTOR途径可诱导体外培养的水牛颗粒细胞发生自噬,细胞自噬与凋亡共同调控颗粒细胞生长。

关键词：水牛颗粒细胞卵泡发育细胞自噬细胞凋亡基因表达

水牛卵泡液中胆汁酸来源及其参与调控卵泡闭锁的研究

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水牛卵泡液中胆汁酸来源及其参与调控卵泡闭锁的研究

作者：魏耀昶广西大学

学位级别：硕士

现在养殖企业的饲料中脂肪的含量越来越高,动物机体不能分泌足量的胆汁来分解脂肪,因此胆汁酸作为饲料添加剂孕育而生。据报道哺乳动物卵泡液中含有丰富的胆汁酸,提示饲料中胆汁酸的添加可能会影响到母畜的生殖机能。本研究以水牛为研... 详细信息

现在养殖企业的饲料中脂肪的含量越来越高,动物机体不能分泌足量的胆汁来分解脂肪,因此胆汁酸作为饲料添加剂孕育而生。据报道哺乳动物卵泡液中含有丰富的胆汁酸,提示饲料中胆汁酸的添加可能会影响到母畜的生殖机能。本研究以水牛为研究对象,首先分析了水牛卵泡中胆汁酸的来源;其次采用靶向代谢组学方法检测了健康卵泡（HF）和闭锁卵泡（AF）中胆汁酸的亚种,和各种胆汁酸的含量;最后研究差异胆汁酸对卵泡颗粒细胞凋亡、增殖及激素分泌的影响。本研究将为探索胆汁酸参与水牛卵泡闭锁提供新观点,也为饲料中添加胆汁酸提供理论依据。研究取得了如下结果:1、探讨了水牛卵泡液中胆汁酸的来源分别通过免疫组化和WB验证胆汁酸的合成酶基因CYP7A1、CYP27A1和胆汁酸的转运体基因NCTP、ASBT是否在卵巢组织表达,结果显示胆汁酸的合成酶基因在卵巢组织不表达,而胆汁酸的转运体基因在卵巢组织上表达;分别在卵泡内膜细胞和卵泡颗粒细胞培养液中添加胆固醇,检测细胞中胆固醇含量和培养液中胆汁酸的含量的变化,结果显示添加胆固醇后细胞中胆固醇含量显著增加（P＜0.05）,但培养液中胆汁酸的含量没有变化,提示卵泡细胞不能合成胆汁酸。2、检测了健康卵泡（HF）和闭锁卵泡（AF）中胆汁酸的亚型和含量根据卵泡的外部特征和内部形态区分HF和AF,并通过检测雌二醇和孕激素的含量以及凋亡相关基因的相对表达量来验证卵泡分类的准确性,结果表明卵泡分类准确;靶向代谢组检测结果显示,各待测物的标准曲线线性良好,R2均大于0.999。根据标准曲线量化HF和AF卵泡液中的胆汁酸。在HF和AF中胆汁酸的种类一致,CA和GCA均是主要的胆汁酸亚型,但各胆汁酸的浓度不同。差异显著的胆汁酸有13种,整体来看,AF中结合型胆汁酸的含量明显高于HF,游离型胆汁酸的含量明显低于HF;HF中的总胆汁酸含量显著高于AF。3、探讨了甘氨脱氧胆酸（GDCA）对体外培养的水牛颗粒细胞功能的影响GDCA是HF和AF中差异最大的结合型胆汁酸,分别向体外培养的颗粒细胞中添加0μM、200μM、300μM、400μM的GDCA,检测颗粒细胞状态的变化。结果表明添加GDCA后,水牛颗粒细胞的凋亡率显著上升（P＜0.01）;E2的分泌显著降低（P＜0.01）;P4的分泌显著降低（P＜0.01）;而EDU阳性率没有变化。检测凋亡、增殖和类固醇合成相关基因的相对表达量,发现GDCA促进了水牛颗粒细胞中凋亡相关基因caspase3、BAX、P53的表达,抑制抗凋亡基因Bcl2的表达,并抑制类固醇相关基因CYP11A1、CYP19A1的表达,而对细胞增殖相关基因PCNA、Cyclind1没有影响。由此,本研究初步表明了水牛卵泡液中的胆汁酸来源于血液的运输,卵泡细胞自身不能合成胆汁酸;HF和AF中胆汁酸亚型存在差异,AF中结合型胆汁酸增多,游离型胆汁酸降低,其中差异结合型胆汁酸GDCA可以通过促进卵泡颗粒细胞凋亡,减少类固醇激素的分泌,从而调控颗粒细胞的功能,参与卵泡闭锁。

关键词：水牛颗粒细胞卵泡闭锁胆汁酸细胞凋亡类固醇激素

介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定

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介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定

作者：宋利军华中农业大学

学位级别：硕士

水牛耐高温、抗病力较强,适宜在高温地区饲养,且水牛奶中乳蛋白和乳脂含量较高。但水牛繁殖力低、产奶量少的缺点,直接限制了奶水牛业的发展。抑制素（Inhibin, INH）抑制垂体合成和分泌FSH,从而影响卵泡发育、精子发生及生殖活动。... 详细信息

水牛耐高温、抗病力较强,适宜在高温地区饲养,且水牛奶中乳蛋白和乳脂含量较高。但水牛繁殖力低、产奶量少的缺点,直接限制了奶水牛业的发展。抑制素（Inhibin, INH）抑制垂体合成和分泌FSH,从而影响卵泡发育、精子发生及生殖活动。RNA干扰（RNA interference, RNAi）在生物体内调节基因表达,可用于干扰INHA的表达。PB （piggyBac transposon）转座子遵循“剪切-粘贴”机制,具有特异性识别位点TTAA、剪切和插入不留下痕迹、稳定整合和传代、负载容量大和转座效率高等特点,且PB转座子具有能删除特定基因（如标记基因GFP）的Cre/LoxP系统,将其与转基因技术相结合可以获得安全的转基因动物。因此,本研究利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体,构建干扰INHA基因表达的转基因载体,经G418筛选获得转基因阳性细胞,为显微注谢或核移植技术获得转基因水牛提供素材,以期为提高水牛繁殖力和对INH基因功能深入研究奠定基础。本研究主要内容如下：（1）构建了5个干扰载体（其中1个瞬时表达载体和4个转基因载体）和3个阴性对照载体。利用瞬时表达载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen构建2个干扰载体psiRNA-1和psiRNA-2;利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体pHi5和pHl,分别构建pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3、pHi5siRNA-4和pH1siRNA-1、PH1siRNA-3、pH1siRNA-4转基因载体;其中psiRNA-1、pHi5siRNA-1和pH1siRNA-1为阴性载体。（2）转基因载体pHi5、pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3和pHi5siRNA-4与转座酶载体混合后分别转染水牛颗粒细胞,通过检测INHA的表达量和孕酮的分泌量,筛选出具有较好干扰效果的片段siRNA-3和siRNA-4, siRNA-3干扰效果更好。（3）初步筛选鉴定出4个转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞。两组转基因载体与转座酶载体混合后分别转染水牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选,观察GFP的表达情况。当筛选到第6d后,有4种细胞系能基本稳定表达GFP,初步表明成功获得转基因阳性细胞,分别为pHi5siRN A-3阳性水牛胎儿成纤维细胞、pHi5siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞、pH1siRNA-3阳性水牛胎儿成纤维细胞和pH1siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞。（4）建立了构建RNAi转基因载体技术,并建立了筛选转基因阳性细胞技术。

关键词：抑制素A PB转座子 RNA干扰水牛颗粒细胞水牛胎儿成纤维细胞