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东亚人群乙醇脱氢酶第47位氨基酸多态性与水稻驯化进程关联

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农业生物技术学报 2010年第1期18卷 155-155页

作者： Courtney H.Wilcox 单位不详

约一万年前,农业的出现标志着人类进化史的显著变化,而农业社会人类饮食方式的改变可能对新石器世代人们的遗传结构有着及其重要的影响。在中国南部及其临近地区人群基因组中,乙醇脱氢酶第47位氨

关键词：氨基酸多态性乙醇脱氢酶水稻东亚

次要组织相容性抗原HA-1:具单个氨基酸多态性的复等位基因

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国际检验医学杂志 1999年第3期20卷 141-141页

作者：魏启欧

骨髓移植（BMT）主要用于治疗血液性恶性肿瘤、再障、免疫缺陷疾病等，HLA相同的同种BMT后常发生危及生命的移植物抗宿主疾病（GVHD）。GvHD的发生不是因为主要组织相容性复合物（MHC）的不同，而是由于供受者在次要组织相容性抗原（mH... 详细信息

骨髓移植（BMT）主要用于治疗血液性恶性肿瘤、再障、免疫缺陷疾病等，HLA相同的同种BMT后常发生危及生命的移植物抗宿主疾病（GVHD）。GvHD的发生不是因为主要组织相容性复合物（MHC）的不同，而是由于供受者在次要组织相容性抗原（mHags）基因上的不同而引起的。T细胞识别的mHags是MHC分子所呈递的细胞内蛋白来源的多肽。回顾性研究表明，在HLA相同的BMT中，决要组织相容性抗原HA－1（mHagHA－1）的错配同GvHD的发生密切相关。作者利用反相HPLC技术，从表达HA－1的EB病毒转化的淋巴细胞中分高纯化得到HA－1，用HA－1特异性的细胞毒T淋巴细胞（CTL）克隆，进行51Cr释放实验验证得到的HA－1样品，并用质谱、毛细管HPLC技术证明HA－1为龙肽结构，并通过纯台子实验证实HA司由KIAA0223等位基因编码，遗传遵循孟德尔规律。作者认为，从HA－1H/R供者移植骨髓到HA－1R/R受者同GvHD的发生密切相关。虽然在人类mnags差异很大，但仅有HA-1同GvHD的发生有密切关系，HLA相同的供受者，骨髓移植前进行HA-1等位基因配型，对于供体选择和降低由HA－1引起的GvHD具有重要意义。

关键词：组织相容性抗原 BMT HLA 同族抗原复等位基因 HA-1 氨基酸多态性

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甲型流感病毒宿主嗜性相关位点的多态性研究

上海预防医学 2023年第7期35卷 626-633页

作者：刘修良李艳娇陈伟杰王雨茜高其乐胡晶晶张志杰熊成龙复旦大学公共卫生学院公共卫生安全教育部重点实验室上海200032

【目的】以甲型流感病毒(IAV)毒株的完整内部蛋白编码基因为基础,发现并分析IAV传播过程中出现的影响宿主嗜性类型的单个或相互作用的关键氨基酸位点,为研究IAV的人类宿主适应性突变提供依据。【方法】在全球流感共享数据库(GISAID)EpiF... 详细信息

【目的】以甲型流感病毒(IAV)毒株的完整内部蛋白编码基因为基础,发现并分析IAV传播过程中出现的影响宿主嗜性类型的单个或相互作用的关键氨基酸位点,为研究IAV的人类宿主适应性突变提供依据。【方法】在全球流感共享数据库(GISAID)EpiFluTM数据库中,根据查询条件获得43671个IAV毒株对应的6个内部基因节段全长核苷酸序列,通过质控与去冗余后保留698个嗜人类亚型(HU)和1266个嗜禽类亚型(AV)代表株,使用R代码比较2种嗜性类别代表株的氨基酸共义序列,获得氨基酸差异位点及其多态性,并对差异位点进行多位点组合分析。【结果】AV与HU中H1N1、H3N2亚型代表株分别进行共有序列比对,各发现49个、57个保守差异位点。差异位点的多位点组合分析,在HU与AV间分别发现79个三位点组合与65个四位点组合。共有11个保守差异位点同时存在于2种组合内:PB2蛋白的271、684位点;PB1蛋白的336、486、581、621位点;PA蛋白的204、356位点;NP蛋白的33、305、357位点;M1和NS1中未发现符合条件的差异位点。【结论】IAV的嗜人和嗜禽类毒株间在PB2、PB1、PA与NP蛋白中存在若干保守氨基酸差异位点,这些位点彼此间可能存在一定形式的互相作用并进而形成特定的组合,共同(而非各自)决定着病毒的宿主嗜性。

关键词：甲型流感病毒基因宿主嗜性氨基酸多态性

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PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用

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PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用

作者：王松姣湖北中医药大学

学位级别：硕士

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影响全世界约2.57亿人,并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷(酸)类似物(NAs))来抑制病毒复制,但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且,耐药性的... 详细信息

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影响全世界约2.57亿人,并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷(酸)类似物(NAs))来抑制病毒复制,但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且,耐药性的发展始于HBV聚合酶基因的突变,随后数周至数月后病毒载量和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。因此,抗HBV耐药性突变的检测对于迅速制定新的治疗方案至关重要。第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价目的本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。方法1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法根据HBV逆转录酶区常见的突变位点,采用Primer Premier 6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA作为模板进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物,以验证目的基因是否被扩增成功。2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建通过掺入Eco RI和Hind III限制性酶切位点的引物扩增HBV DNA模板,然后分别用限制性内切酶Eco RI和Hind III消化纯化的PCR产物和p UC19克隆载体。在使用T4 DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后,下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析,以确定重组质粒标准模板是否构建成功。3 PCR产物直接测序法的评价将得到的重组菌株扩大培养,并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板,重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rt M204I突变标本连续重复检测10天,分析该耐药位点的突变检出率,以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rt M204I突变型重组质粒,将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中;对混合DNA模板进行PCR扩增,然后应用Mutation Surveyor软件对测序结果进行比对分析,以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测,以评价该方法的特异性。结果(1)通过优化PCR扩增体系和条件,建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μL PCR扩增体系为:蒸馏水33μL,20 mmol/L 10×扩增缓冲液(Mg2+plus)5μL,4种d NTP混合物(每种浓度为2.5 mmol/L)4μL,Ex Taq聚合酶(5 U/μL)1μL,上游引物(10μmol/L)1μL,下游引物(10μmol/L)1μL,模板DNA 5μL(性5 min;94℃变性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min;循环40次;最后72℃延伸5 min。(2)通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。(3)该方法对血清HBV DNA的检测范围为0.36 copies/μL至2.88×1011 copies/μL,联合应用Mutation Surveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析,rt M204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBV DNA阴性标本中均未检出目的条带。结论本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点,具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点,联合应用Mutation Surveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用目的HBV耐药源于长期使用核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶(RT)发生突变。到目前为止,这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此,本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测,以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。方法应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析,并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。结果408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示,HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示

关键词：乙型肝炎病毒耐药突变 PCR产物直接测序基因型氨基酸多态性

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对两种呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的抗性风险评估

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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对两种呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡...

作者：张晓柯南京农业大学

学位级别：硕士

由子囊菌亚门的灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病,是一种重要的世界性病害。该病原菌寄主十分广泛,能够侵染200余种植物,包括水果、蔬菜、花卉等植物,可造成重要的经济损失。目前,由于缺少有效的抗病品种,且该病原菌具有产孢量... 详细信息

由子囊菌亚门的灰葡萄抱菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病,是一种重要的世界性病害。该病原菌寄主十分广泛,能够侵染200余种植物,包括水果、蔬菜、花卉等植物,可造成重要的经济损失。目前,由于缺少有效的抗病品种,且该病原菌具有产孢量大,繁殖速度快、易产生遗传变异等特点,因此,在生产上灰霉病的防控主要以化学防治为主。烯肟菌胺(SYP-1620)和氟吡菌酰胺(Fluopyram)是两种新型的线粒体呼吸抑制剂。前者是由沈阳化工研究院研发、于2009年在我国完成登记的一种新型、广谱杀菌剂,其作用于菌体线粒体复合物Ⅲ(细胞色素bcl复合体Qo位点)的泛醌,抑制其呼吸作用。然而目前,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌的生物学研究尚未涉及。氟吡菌酰胺是由拜耳研发的,于2012年在我国完成登记,是一种作用于菌体线粒体复合物Ⅱ[琥珀酸脱氢酶(SDH)]的新型杀菌剂,可用于防治70多种作物病害,其中对灰葡萄孢菌、白粉病菌、核盘菌和丛梗孢属引起的病害有特效。然而,氟吡菌酰胺在灰霉病的防治方面研究较少。因此,本文研究了灰葡萄孢菌对两种新型呼吸抑制剂烯肟菌胺和氟吡菌酰胺的生物学特性,旨在揭示这两种抑制剂与同类药剂之间的差异与相似,从而为灰霉病的防治提供合理的科学指导。本研究主要获得的结果如下:首先,研究了灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线及潜在抗性风险。结果表明:在离体条件下,烯肟菌胺对灰葡萄孢菌菌丝生长及孢子萌发均表现出很强的抑菌活性,采用菌丝生长速率法建立的108株灰葡萄孢菌对烯肟菌胺的敏感性基线平均EC50为 0.0130 ±0.0109 μg/mL,孢子萌发法的平均 EC50 为 0.01147 ±0.0062 μg/mL;无论是在草莓还是黄瓜幼苗上,烯肟菌胺均表现出良好的保护与治疗作用,且保护作用优于治疗作用;与敏感菌株相比,烯肟菌胺抗性突变体适合度略有降低;该杀菌剂与同类杀菌剂嘧菌酯有正交互抗性,与其它类型的杀菌剂无交互抗性;所测定的抗药性突变体均在cyt b基因发生单点突变(G143A)。因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对烯肟菌胺具有高水平抗药性风险;烯肟菌胺具有与其他QoIs相类似的毒理学机制。其次,研究了灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险及抗性检测技术。结果表明:100株灰葡萄孢菌菌丝生长平均EC50为1.94 ± 1.55 μg/mL,所建敏感性基线接近正态分布;氟吡菌酰胺的田间抗性菌株适合度显著低于敏感菌株,均在琥珀酸脱氢酶B亚基发生单点突变(H272R);但田间抗性菌株与同类杀菌剂啶酰菌胺及其它类型的杀菌剂之间不存在正交互抗性;因此,研究结果表明,灰葡萄孢菌对氟吡菌醜胺的抗性风险属于低至中等水平;利用反向引物3'端加入错配碱基,建立了 ASO-PCR快速检测抗性基因型(H272R)的分子检测技术,该技术能够快速、有效的检测田间特定抗性基因型菌株。最后,研究了灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶C亚基氨基酸多态性与SDHIs药敏性之间的关系。在前面研究中,我们发现部分氟吡菌酰胺抗、感菌株C亚基均发生了变化,且对药剂的敏感性差异很大,我们推测,敏感性的差异可能与SDHIs的靶标SDH有关。为此,本文分析了来自我国不同区域的52株田间灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶B、C和D亚基的全序列,与测序菌株B05.10相比,发现仅C亚基氨基酸序列存在多态性,共分为5种类型(C0-C4)。这5种类型的菌株对SDHIs药敏性及生物适合度存在显著性差异。通过基因替换技术,构建了无遗传背景差异的5种氨基酸序列多态性的载体,经过PCR验证和Southern杂交验证,获得了相应的突变体(R-CO—R-C4),测定了这5种突变体对啶酰菌胺和氟吡菌醜胺的敏感性,结果表明:R-C0突变体对SDHIs的敏感性明显的高于其余4种多态性突变体。在菌丝生长、产孢量、对碳源利用能力、番茄和草莓叶片上致病力测定中,5种多态性突变体之间存在显著性差异;但在苹果及洋葱上的致病力差异不显著。此外,在一定浓度百草枯作用下,R-C0突变体对百草枯诱导的氧化胁迫的耐受性要低于其余4种多态性突变体。综上所述,烯肟菌胺和氟吡菌酰胺对灰葡萄孢菌均具有很强的抑菌活性,可以用来防治田间的灰霉病,但在实际生产中应注意采用药剂交替使用或混用从而延长杀菌剂的使用寿命。在交互抗性测定中,烯肟菌胺与同类嘧菌酯有正交互抗性,它们之间存在相同的作用机制,而氟吡菌酰胺与啶酰菌胺不存在正交互抗性,作用机制可能存在一定的差异。C亚基多态性与SDHIs类药剂的敏感性有关。

关键词：烯肟菌胺氟吡菌酰胺灰葡萄孢菌生物活性抗性研究 SdhC亚基氨基酸多态性