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毒胡萝卜素对人晶状体上皮细胞的影响及机制

毒胡萝卜素对人晶状体上皮细胞的影响及机制

作者：张霞扬州大学

学位级别：硕士

第一部分毒胡萝卜素对人眼离体前囊膜晶状体上皮细胞的影响目的:探讨毒胡萝卜素对年龄相关性白内障患者离体前囊膜晶状体上皮细胞的影响。方法:收集2020年2月1日至2020年9月1日在扬州大学附属医院眼科门诊诊断为年龄相关性白内障并接受P... 详细信息

第一部分毒胡萝卜素对人眼离体前囊膜晶状体上皮细胞的影响目的:探讨毒胡萝卜素对年龄相关性白内障患者离体前囊膜晶状体上皮细胞的影响。方法:收集2020年2月1日至2020年9月1日在扬州大学附属医院眼科门诊诊断为年龄相关性白内障并接受PHACO手术患者的晶状体前囊膜,共计184片,均采用连续环形撕囊（CCC）取出。分为两大组:毒胡萝卜素（TG）组和TG联合冲洗（模拟I/A）组。TG组共104片前囊膜,随机均分为4组:对照组、0.5μMTG组、1.0 μM TG组、2.0 μM TG组。每组取20片用于前囊膜晶状体上皮细胞（LECs）死亡率的研究,取3片行扫描电子显微镜（SEM）、3片行透射电子显微镜（TEM）检查,观察不同浓度TG处理后的LECs形态学及微观结构改变情况。TG联合冲洗组（模拟I/A）共80片前囊膜,随机均分为4组:对照组、0.5μMTG联合冲洗组、1.0μMTG联合冲洗组、2.0μM TG联合冲洗组,用于前囊膜LECs脱落面积的研究。采用Image J软件进行LECs死亡率和脱落面积计算;SPSS 23.0软件对数据进行统计分析,采用Welch方差分析比较TG组和TG联合冲洗（模拟I/A）组组间的细胞死亡率和脱落面积;采用Games-Howell检验进行细胞死亡率和细胞脱落面积占比组间两两比较。结果:***促进人眼离体前囊膜LECs死亡对照组、0.5 μM TG组、1.0 μM TG组、2.0 μM TG组前囊膜LECs死亡率组间差异有统计学意义（WelchF=21.514,P＜0.001）。TG浓度为0.5 μM、1.0μM、2.0 μM时,作用3 min可导致离体前囊膜LECs死亡率增加（P＜0.05）。***促进人眼离体前囊膜LECs的清除对照组、0.5 μM TG联合冲洗组、1.0 μM TG联合冲洗组、2.0μM TG联合冲洗组前囊膜LECs脱落面积占比组间差异有统计学意义（Welch F=26.408,P＜0.001）。TG浓度为0.5 μM、1.0 μM、2.0 μM时,作用3 min后用BSS冲洗离体前囊膜1 min,可导致LECs脱落面积占比增加（P＜0.05）,有助于离体前囊膜LECs的清除。3.电子显微镜检查（1）TEM检查:离体晶状体前囊膜经过BSS处理后,LECs呈现单层排列分布,与前囊膜紧密连接,LECs胞间连接紧密,细胞及细胞器形态、结构完整。随着TG浓度的增加,LECs胞间连接逐渐松散、消失,细胞及细胞器形态、结构逐渐破损。经过2.0μM TG处理后,LECs与前囊膜连接完全消失,呈现完全分离状态,大部分细胞内结构辨认不清,细胞膜破裂,胞内容物溶解、流出。（2）SEM检查:离体晶状体前囊膜经过BSS处理后,LECs形态正常,呈单层排列,与前囊膜紧密连接,LECs胞间连接紧密,细胞膜完整,LECs表面可见大量圆形突起、球体及微绒毛。随着TG浓度的增加,LECs逐渐皱缩和破损,胞内容物流出,胞间连接逐渐中断、消失。结论:***（浓度为0.5 μM-2.0 μM）可导致人眼离体前囊膜LECs死亡。***（浓度为0.5 μM-2.0 μM）联合冲洗（模拟I/A）可导致人眼离体前囊膜LECs脱落。***（浓度为0.5μM-2.0μM）可导致人眼离体前囊膜LECs形态和微观结构呈坏死样改变,还可以导致LECs与前囊膜连接疏松,随着TG浓度的增加,作用效果越明显。第二部分毒胡萝卜素对人晶状体上皮细胞（SRA 01/04）生物学特性的影响及分子机制目的:研究毒胡萝卜素对体外培养的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）生物学特性的影响及分子机制。方法:设置不同浓度的TG组,分别为对照组、0.5 μMTG组、1.0 μMTG组、2.0μM TG组。通过划痕实验和Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、CCK-8和EdU实验检测人晶状体上皮细胞（LECs）的迁移、侵袭、增殖能力;流式细胞术检测LECs凋亡情况;Western Blot检测LECs凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax）、内质网应激蛋白（GRP78、CHOP）和上皮-间质转分化蛋白（α-SMA、Vimentin、Fibronectin、E-cadherin）表达情况。结果:***抑制LECs迁移:对照组、0.5μMTG组、1.0μMTG组、2.0μMTG组划痕愈合百分比和细胞迁移数组间差异有统计学意义（P＜0.05）。划痕愈合百分比和细胞迁移数随着TG浓度的升高而降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。***抑制LECs侵袭:对照组、0.5μM TG组、1.0 μM TG组、2.0 μMTG组细胞侵袭数组间差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞侵袭数随着TG浓度的升高而降低,差异具

关键词：毒胡萝卜素晶状体上皮细胞凋亡

NR4A1对毒胡萝卜素诱导C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响

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山东大学学报（医学版） 2023年第11期61卷 38-47页

作者：芦兴晨强晔刘昕宇左丹姜子晗张玉超刘元涛马小莉青岛大学附属青岛临床医学院青岛市市立医院山东青岛266011 康复大学青岛医院(青岛市市立医院)内分泌中心山东青岛266011 烟台毓璜顶医院莱山分院临床营养科山东烟台264000 康复大学青岛医院(青岛市市立医院)医学杂志编辑部山东青岛266011 山东大学齐鲁医院内分泌科(青岛) 山东青岛266011

目的探讨NR4A1对毒胡萝卜素(TG)诱导小鼠C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响及机制。方法体外诱导C2C12细胞分化为成熟肌管细胞,将加入20 nmol/L胰岛素刺激10 min的细胞标记为胰岛素组,未做特殊处理的细胞标记为对照组,采用Western blot... 详细信息

目的探讨NR4A1对毒胡萝卜素(TG)诱导小鼠C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响及机制。方法体外诱导C2C12细胞分化为成熟肌管细胞,将加入20 nmol/L胰岛素刺激10 min的细胞标记为胰岛素组,未做特殊处理的细胞标记为对照组,采用Western blotting法检测磷酯酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、NR4A1蛋白水平。采用CCK8法检测TG浓度梯度处理的C2C12肌管细胞活力,建立糖代谢损伤细胞模型。将C2C12肌管细胞分为对照组、无水乙醇(EtOH)组、TG组,分别处理后加入胰岛素刺激,采用葡萄糖试剂盒检测葡萄糖消耗水平,采用Western blotting法检测NR4A1、p⁃PI3K、p⁃AKT蛋白表达。采用慢病毒感染并筛选,获得对照与稳定过表达NR4A1的C2C12肌管细胞,并进行TG处理,分为Ad⁃NC组、Ad⁃NC+EtOH组、Ad⁃NC+TG组和Ad⁃NR4A1+TG组。分化成熟后加入胰岛素刺激,检测葡萄糖消耗水平,检测NR4A1、p⁃PI3K、p⁃AKT的表达。结果与对照组相比,胰岛素组C2C12肌管细胞PI3K/AKT通路磷酸化水平及NR4A1表达水平显著升高(P<0.01)。CCK⁃8结果显示,TG浓度大于1μmol/L时,细胞活力显著下降(P<0.01)。与EtOH组相比,TG组葡萄糖消耗减少,NR4A1表达水平下降,PI3K/AKT蛋白磷酸化水平受到抑制(P均<0.01)。胰岛素刺激C2C12肌管细胞,与Ad⁃NC+TG组相比,Ad⁃NR4A1+TG组葡萄糖消耗增加(P<0.05)、PI3K/AKT信号通路显著活化(P<0.05)。结论TG导致C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍。NR4A1对TG诱导的C2C12肌管细胞糖代谢障碍具有改善作用,其机制可能通过PI3K/AKT信号途径发挥作用。

关键词： NR4A1 C2C12肌管细胞磷酯酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B信号通路毒胡萝卜素糖代谢

钙网蛋白促进毒胡萝卜素诱导的胰腺癌细胞间质转化

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中华普通外科杂志 2022年第7期37卷 524-529页

作者：盛伟伟唐景彤曹容衔陈霖田晨董明中国医科大学附属第一医院胃肠外科沈阳110001

目的探讨钙网蛋白(calreticulin,CRT)在毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导胰腺癌细胞上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的作用及其机制。方法免疫组化检测CRT在胰腺癌组织中表达差异,分析其与胰腺癌患者临床病... 详细信息

目的探讨钙网蛋白(calreticulin,CRT)在毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导胰腺癌细胞上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的作用及其机制。方法免疫组化检测CRT在胰腺癌组织中表达差异,分析其与胰腺癌患者临床病理学参数的关系。免疫印迹和Transwell检测CRT沉默对TG诱导EMT表型影响。Fluro-4/AM和共聚焦显微镜检测胰腺癌细胞胞浆内钙离子水平。结果CRT在胰腺癌组织中高表达(P<0.01),与淋巴结转移(P=0.017)、UICC分期(P=0.021)呈正相关,与E钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达呈负相关(P=0.013)。CRT高表达联合E-cad低表达胰腺癌患者预后不良(P=0.023)。在胰腺癌细胞中,TG诱导EMT表型被CRT沉默所逆转。同时,CRT沉默能够抑制TG诱导胰腺癌胞浆内钙离子增加。结论CRT通过介导TG对胞浆内钙离子调控,最终促进胰腺癌细胞EMT的发生。

关键词：胰腺肿瘤钙网蛋白毒胡萝卜素上皮细胞间质转化

毒胡萝卜素诱导内质网应激对小鼠调节性T细胞免疫功能的影响

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解放军医学杂志 2018年第6期43卷 459-464页

作者：冯珍珍刘萤董宁于燕马涛姚咏明天津医科大学总医院普通外科天津300052 解放军总医院第一附属医院创伤研究中心北京100048

目的探讨内质网应激(ERS)特异性诱导剂毒胡萝卜素(TG)体外刺激对小鼠调节性T细胞(Treg)免疫功能及ERS相关信号通路的影响。方法采用免疫磁珠分离法分选BALB/c小鼠脾脏Treg,流式细胞术检测其分选纯度。采用流式细胞术检测Treg叉头翼状螺... 详细信息

目的探讨内质网应激(ERS)特异性诱导剂毒胡萝卜素(TG)体外刺激对小鼠调节性T细胞(Treg)免疫功能及ERS相关信号通路的影响。方法采用免疫磁珠分离法分选BALB/c小鼠脾脏Treg,流式细胞术检测其分选纯度。采用流式细胞术检测Treg叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)表达的时间及剂量效应关系。Western blotting检测细胞ERS信号通路相关分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、真核细胞转录起始因子2α(e IF2α)、磷酸化e IF2α(p-e IF2α)、转录激活因子4(ATF4)表达/活化水平。将Treg单独或与效应T细胞(Teff)共培养,采用流式细胞术检测Teff的增殖活性,ELISA法检测Treg白细胞介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β生成以及共培养上清中IL-2、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平。结果磁珠分选Treg的纯度为91.0%。依据Treg Foxp3及CTLA-4表达的时效-量效关系,选定TG 0.1μmol/L和12h为实验刺激浓度和时间。0.1μmol/L TG刺激12h后,Treg中ERS信号通路相关分子GRP78、磷酸化e IF2α、ATF4等表达/活化水平明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,TG刺激组Treg IL-10和TGF-β分泌量明显增加,其对Teff增殖活性抑制能力明显增强,与Teff共培养上清中IL-4/IFN-γ比值明显升高,IL-2水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TG能够有效地活化Treg中ERS相关信号通路,进而显著增强Treg介导的免疫抑制反应。

关键词：调节性T细胞免疫功能内质网应激毒胡萝卜素

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毒胡萝卜素诱导PC12细胞凋亡的实验研究

医学信息 2022年第8期35卷 71-73+84页

作者：严利黄赛玉湘潭医卫职业技术学院临床学院

目的研究毒胡萝卜素（Thapsigargin）对PC12细胞的影响。方法将体外常规培养的PC12细胞分为正常组和Thapsigargin组，利用Thapsigargin诱导PC12细胞凋亡，建立缺血后神经元损伤模型。采用MTT法检测存活率，采用Annexin V-FITC/PI法检... 详细信息

目的研究毒胡萝卜素（Thapsigargin）对PC12细胞的影响。方法将体外常规培养的PC12细胞分为正常组和Thapsigargin组，利用Thapsigargin诱导PC12细胞凋亡，建立缺血后神经元损伤模型。采用MTT法检测存活率，采用Annexin V-FITC/PI法检测凋亡率情况。结果 Thapsigargin组吸光度A值为（0.1497±0.0357），低于正常组的（0.2573±0.0093），差异有统计学意义（P<0.05）;Thapsigargin组早期凋亡率及总凋亡率高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;Thapsigargin组JNK3、Caspase-3蛋白表达高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 JNK3、Caspase-3可能参与了神经细胞的损伤过程。

关键词：毒胡萝卜素 PC12细胞凋亡内质网应激

毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡影响及部分机制的初步探讨

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中国药理学通报 2012年第9期28卷 1281-1285页

作者：王亚丽李俊黄成黄艳于明哲任丹阳徐涛安徽医科大学药学院安徽合肥230032

目的研究内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)标识物葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein,GRP)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein,CHOP)在人胚肺成纤维细胞凋亡过程中的表达变化,初步探讨毒胡萝卜素对人胚肺成纤维细胞凋亡的作用及部分机制。方法体外用毒胡萝卜素(TG)诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)后,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡变化,RT-PCR检测细胞中GRP78、CHOPmRNA的表达变化,Western blot检测GRP、CHOP及Caspase-3蛋白的表达情况。结果与对照组比较,经TG作用24 h后,细胞凋亡率增加,并呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P毒胡萝卜素可诱导人胚肺成纤维细胞发生凋亡,该凋亡可能与ERS有关。

关键词：内质网应激人胚肺成纤维细胞毒胡萝卜素 GRP CHOP Caspase-3

毒胡萝卜素对小鼠肺成纤维细胞内钙离子水平及caspase-3蛋白表达的影响

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四川大学学报（医学版） 2018年第3期49卷 380-383,413页

作者：闫宇肖坤梁晓飞张梦柔毛凯璇封帆肖永红华北理工大学临床医学院唐山063000 华北理工大学公共卫生学院唐山063000

目的探讨钙泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对体外小鼠肺成纤维细胞内钙离子(Ca^(2+))水平及凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)表达的影响。方法小鼠肺成纤维细胞(L929)分为3组:空白对照组(不做处理)、转... 详细信息

目的探讨钙泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对体外小鼠肺成纤维细胞内钙离子(Ca^(2+))水平及凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)表达的影响。方法小鼠肺成纤维细胞(L929)分为3组:空白对照组(不做处理)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)组、TG组,后两组均用5ng/mL TGF-β_1诱导24h,TG组在诱导后再用4μmol/L TG作用24h。细胞处理48h后,分别收集各组细胞,采用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化,激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Ca^(2+)水平,免疫细胞化学方法检测caspase-3蛋白表达。结果透射电子显微镜示,空白对照组细胞凋亡较少,TGF-β_1组无明显凋亡细胞,TG组有大量成纤维细胞凋亡。TGF-β_1组Ca^(2+)水平和caspase-3蛋白水平均低于空白对照组(P<0.05),TG组细胞内Ca^(2+)水平和caspase-3蛋白水平均较TGF-β_1组、空白对照组升高(P<0.05)。结论TG可使小鼠肺成纤维细胞细胞内钙稳态失衡,增加caspase-3蛋白表达,促进细胞凋亡。

关键词：肺成纤维细胞毒胡萝卜素钙离子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3

毒胡萝卜素通过ATF6途径促进柯萨奇病毒B3复制的初步研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2019年第3期33卷 244-247页

作者：宋芹芹罗小暖宋娟夏冬史冰田刘宓夏志强王文军曹天宇程恒顺韩俊中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室传染病诊断和治疗协同中心北京 102206

目的探讨内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对柯萨奇病毒B3(coxsachievirus B3,CV-B3)病毒复制的影响.方法将10个MOI的病毒感染HeLa细胞后,在病毒的吸附和补液过程中加入0.25μmol/L的TG,分别在药物刺激的3 h、6 h和9 h收... 详细信息

目的探讨内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对柯萨奇病毒B3(coxsachievirus B3,CV-B3)病毒复制的影响.方法将10个MOI的病毒感染HeLa细胞后,在病毒的吸附和补液过程中加入0.25μmol/L的TG,分别在药物刺激的3 h、6 h和9 h收集病毒感染的样品.通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CV-B3病毒复制效率;分别使用0.25μmol/L、0.08μmol/L和0.025μmol/L的TG刺激CV-B3病毒感染细胞,通过噬斑形成试验进一步验证TG对病毒复制的影响;通过内质网应激3条通路的抑制剂分别作用于TG刺激的病毒感染细胞,通过qRT-PCR检测病毒量的变化.结果 qRT-PCR结果显示,TG刺激后,相对于对照,病毒量在3 h没有发生明显的变化;在病毒感染的6 h和9 h,病毒量分别增加了2.5倍和158.6倍.噬斑形成试验显示,TG作用后,病毒的噬斑明显增大.通过加入内质网应激的3条通路PERK、ATF6和IRE1的抑制剂GSK2656157、AEBSF和STF-083010发现,加入ATF6的抑制剂AEBSF 6 h后,病毒增加量下降了90%;AEBSF作用9 h后,病毒增加量下降了55%.结论 TG能够通过ATF6途径诱导内质网应激并有效的促进CV-B3病毒的复制.

关键词： Coxsacievirus B3 毒胡萝卜素内质网应激噬斑 ATF6通路

毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡及其机制的实验研究

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中国实验血液学杂志 2006年第1期14卷 25-30页

作者：冯献启游泳肖娟邹萍华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所武汉430022

本研究旨在探讨毒胡萝卜素对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,annexinⅤ-FITC/PI双染法FCM检测凋亡率的变化,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM法荧光分光光度计测定细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的改变,Rh... 详细信息

本研究旨在探讨毒胡萝卜素对K562细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。采用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态变化,annexinⅤ-FITC/PI双染法FCM检测凋亡率的变化,Ca2+荧光指示剂Fura-2/AM法荧光分光光度计测定细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的改变,Rh123单染法FCM检测线粒体ΔΨm的变化,Western blot检测caspase-3,-7,-9,-12、细胞色素C和GRP78蛋白的改变。结果显示:4μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞48小时后,荧光显微镜观察到细胞呈典型的凋亡形态变化,早期凋亡细胞核染色质呈固缩状、圆珠状或斑块状;晚期凋亡细胞核染色质呈固缩状或斑块状。1、2、4、8μmol/L毒胡萝卜素作用K562细胞24和48小时后细胞凋亡率分别为7.51%、11.65%、23.22%、30.56%和12.85%、20.27%、31.51%、44.16%,在一定范围内呈剂量和时间依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P毒胡萝卜素诱导K562细胞[Ca2+]i升高以及线粒体ΔΨm下降,并均呈一定的浓度依赖性,与对照组比较,均有统计学意义(P毒胡萝卜素诱导K562细胞caspase-3,-7,-9,-12剪切活化、细胞色素C释放、GRP78表达上调。结论:毒胡萝卜素可诱导K562细胞发生内质网应激反应性凋亡,内质网是细胞内诱导凋亡的一个重要新场所;caspase-3,-7,-9,-12剪切和活化、线粒体ΔΨm破坏和细胞色素C释放是毒胡萝卜素诱导K562细胞凋亡的重要机制之一,线粒体参与内质网应激反应性凋亡途径并发挥重要作用。

关键词：毒胡萝卜素白血病细胞系,K562细胞细胞凋亡内质网 caspase