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残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体内软骨的形成

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中国组织工程研究 2017年第21期21卷 3312-3319页

作者：蔡震蒋海越四川省医学科学院·四川省人民医院整形外科四川省成都市610072 中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院整形七科北京市100144

背景:先天性小耳畸形残耳软骨细胞从细胞数量和质量上难以作为种子细胞构建出正常人耳郭大小的同质耳软骨支架。目的:探讨残耳软骨细胞能否在裸鼠体内非软骨环境下模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源的干细胞向软骨分化并形成组织工程软骨... 详细信息

背景:先天性小耳畸形残耳软骨细胞从细胞数量和质量上难以作为种子细胞构建出正常人耳郭大小的同质耳软骨支架。目的:探讨残耳软骨细胞能否在裸鼠体内非软骨环境下模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源的干细胞向软骨分化并形成组织工程软骨,从而为解决组织工程化人耳郭软骨支架制备做基础准备工作。方法:(1)实验分为4组:第2代残耳软骨细胞与第3代脂肪来源的干细胞以3∶7比例混合作为共移植组,单纯残耳软骨细胞作为阳性对照组(残耳软骨细胞组),单纯脂肪来源的干细胞作为阴性对照组(脂肪干细胞组),以上3组接种细胞终浓度为5.0×10^(10) L^(-1),低浓度残耳软骨细胞对照组细胞终浓度为1.5×10^(10) L^(-1);(2)按照实验分组将0.2 mL细胞-Pluronic-F127复合物注射到裸鼠背部皮下,体内培养8周后对新生组织进行大体观察、湿质量测量、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色检测。结果与结论:(1)共移植组平均湿质量达到残耳软骨细胞组的80%以上;低浓度残耳软骨细胞对照组平均湿质量低于残耳软骨细胞组的30%;(2)共移植组和残耳软骨细胞组的平均湿质量和糖胺多糖平均含量均显著高脂肪干细胞组和低浓度残耳软骨细胞对照组(P残耳软骨细胞组与低浓度残耳软骨细胞对照组标本均有成熟的软骨陷窝形成,低浓度残耳软骨细胞对照组软骨陷窝松散排列不均,胞外基质着色淡;脂肪干细胞组为纤维样组织,未见软骨陷窝形成;(4)Ⅱ型胶原免疫组化染色:共移植组、残耳软骨细胞组与低浓度残耳软骨细胞对照组可见成熟软骨陷窝周围有不同程度的棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达;脂肪干细胞组未见Ⅱ型胶原表达;(5)结果提示,残耳软骨细胞能够在裸鼠体内非软骨环境下模拟软骨诱导微环境,促进脂肪干细胞向软骨分化并生成组织工程软骨。

关键词：软骨细胞脂肪类干细胞组织工程脂肪干细胞残耳软骨细胞脂肪来源干细胞软骨形成共移植诱导体内

单例先天性小耳残耳软骨细胞体外构建人耳廓软骨

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基础医学与临床 2014年第5期34卷 583-588页

作者：康宁刘霞曹谊林肖苒中国医学科学院整形外科医院研究中心北京100144

目的探讨单例先天性小耳残耳软骨细胞体外构建正常人大小耳廓形态组织工程软骨的可行性.方法分离40例小耳畸形患者残耳软骨细胞统计细胞提取率;MTT法检测细胞增殖能力、计算扩增效率;免疫荧光和PCR检测不同代数细胞的软骨表型.分别应... 详细信息

目的探讨单例先天性小耳残耳软骨细胞体外构建正常人大小耳廓形态组织工程软骨的可行性.方法分离40例小耳畸形患者残耳软骨细胞统计细胞提取率;MTT法检测细胞增殖能力、计算扩增效率;免疫荧光和PCR检测不同代数细胞的软骨表型.分别应用3例患者各自的残耳软骨细胞培养至P3～P4代,藻酸盐凝胶包埋接种于正常人大小耳廓形态的聚羟基乙酸/聚乳酸支架,体外成软骨诱导动态培养10周后行组织学染色观察.结果耳软骨细胞提取率为（3.90±1.27）×106/g;在增殖培养基中细胞增殖能力明显提高,至P4代扩增（328.4 ±50.4）倍（P＜0.05）;P3代细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达显著减弱,至P4代消失,Ⅰ型胶原表达增强;体外培养10周,实验组形成了耳廓形态的类软骨组织,可见典型软骨陷窝,番红O、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性;对照组明显变形,未形成软骨结构.结论单例先天性小耳残耳软骨细胞经体外扩增和动态诱导培养可在体外构建正常人大小耳廓软骨.

关键词：先天性小耳畸形残耳软骨细胞耳廓形态软骨组织工程

先天性小耳畸形残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养构建组织工程软骨的实验研究

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先天性小耳畸形残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养构建组织工程软骨...

作者：张洁北京协和医学院

学位级别：硕士

第一部分残耳软骨细胞诱导脂肪干细胞向软骨分化的实验研究目的研究ADSCs的体外生长的生物学特性及其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法利用先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织与脂肪组织,胶原酶消化法从组织中... 详细信息

第一部分残耳软骨细胞诱导脂肪干细胞向软骨分化的实验研究目的研究ADSCs的体外生长的生物学特性及其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法利用先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织与脂肪组织,胶原酶消化法从组织中提取脂肪干细胞,体外传代培养及生物学特性研究：细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志物,多向分化诱导检测,其向软骨、骨、脂肪及内皮多向分化诱导能力检测。胶原酶消化法从组织中提取残耳软骨细胞、脂肪干细胞,脂肪干细胞与残耳软骨细胞隔离共培养,检测残耳软骨细胞微环境能否诱导脂肪干细胞向软骨方向分化：Alcian Blue染色;RT-PCR检测Collagen II基因及Aggrecan基因的表达。结果ADSCs呈成纤维细胞样生长,生长旺盛;流式细胞仪检测显示：CD44,CD105阳性, CD34,CD45,CD106,CD117为阴性;成骨诱导茜素红染色显示钙化基质沉积表达;成脂肪诱导油红-0染色阳性,胞浆内见脂滴形成;成软骨诱导细胞聚集成小团块,番红0染色显示蛋白聚糖表达阳性。结论成功分离培养出脂肪干细胞,ADSCs生长增殖能力强,高表达干细胞相关抗原,可长期传代,具有多向分化潜能可向软骨,骨,脂肪等多个方向分化,可作为组织工程软骨构建的种子细胞。残耳软骨细胞能够在体外模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs向软骨分化。第二部分残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究目的残耳软骨细胞与ADSCs在裸鼠体内构建组织工程软骨最佳细胞比的初步研究。方法实验分组：第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs以1：9的比例混合作为实验组(Exp1),以3:7的比例混合作为实验组(Exp2),以5:5的比例混合作为实验组(Exp3),单纯残耳软骨细胞作为阳性对照组(Ctrl.1),单纯ADSCs作为阴性对照组(Ctrl.2),Exp1、Exp2、Exp3、Ctrl.1和Ctrl.2组接种细胞终浓度为5.0×107/ml,单纯低密度残耳软骨细胞对照组(Ctrl.3)细胞终浓度为2.5×107/ml。每组按各自的细胞浓度1将0.2ml的细胞量与Pluronic-F127复合物混合后注射到裸鼠背部皮下,每组接种6只裸鼠。体内培养10周后取材,通过对新生组织的大体观察、湿重比较、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色检测以及Realtime PCR检测相关基因表达,初步找到体内构建组织工程软骨残耳软骨细胞与ADSCs之间的最佳比例。结果Exp2、Exp3组与Ctrl.1组注射部位形成白色软骨样组织,3组新生组织的大小相仿,外观和弹性与正常软骨相似;Ctrl.2组形成纤维样组织,质软,色淡黄;Exp1、Ctrl.3组形成的软骨样组织表面光泽度及弹性差,新生组织量也明显较Exp2、Exp3组与Ctrl.1组少。Exp2、3组平均湿重分别达到达到Ctrl.1组的87%及88.7%;Exp1、Ctrl.3组平均湿重分别低于Ctrl.1组平均湿重的33%及40%;Exp2、Exp3组平均GAG含量达到Ctrl.1组的90%以上;Exp2、Exp3组和Ctrl.1组的平均湿重和GAG平均含量均显著高于Exp1、Ctrl.2组和Ctrl.3组(P软骨陷窝形成,Exp1、Ctrl.3组与Exp2、Exp3、Ctrl.1组相比较,软骨陷窝松散排列不均,软骨陷窝较大;Ctrl.2组为纤维样组织,未见软骨陷窝形成。Ⅱ型胶原免疫组化染色：Exp1、Exp2、Exp3组、Ctrl.1组与Ctrl.3组标本均可见成熟软骨陷窝周围有不同程度的棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达;Ctrl.2组未见Ⅱ型胶原表达。共移植组(Exp2)和共移植组(Exp3)在相关基因表达方面与阳性对照组(Ctrl.1)相近似(p>0.05),而ADSCs对照组(Ctrl.2)及低密度残耳软骨细胞对照组(Ctrl.3)以及共移植组(Exp1)与阳性对照组(Ctrl.1)在相关基因表达方面差异较明显(p残耳软骨细胞与ADSCs在裸鼠体内构建组织工程软骨的上述三个比例中,3:7为最佳比例。

关键词：残耳软骨细胞 ADSCs 表型多向分化共培养残耳软骨细胞 ADSCs 软骨组织共移植最佳比例体内

残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究

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组织工程与重建外科杂志 2011年第2期7卷 75-79页

作者：张洁蒋海越何乐仁赵延勇杨庆华韩娟宋宇鹏中国医学科学院整形外科医院北京市100144

目的验证残耳软骨细胞与脂肪来源的间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养,体内构建软骨的可行性。方法分离培养同一先天性小耳畸形患者来源的残耳细胞及脂肪干细胞。24只裸鼠随机分为4组:①实验组,接种残耳软骨细胞及... 详细信息

目的验证残耳软骨细胞与脂肪来源的间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养,体内构建软骨的可行性。方法分离培养同一先天性小耳畸形患者来源的残耳细胞及脂肪干细胞。24只裸鼠随机分为4组:①实验组,接种残耳软骨细胞及脂肪干细胞,两种细胞以1∶1比例混合,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;②对照组1,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;③对照组2,接种单纯ADSCs,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;④对照组3,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为2.5×107 cells/mL。每组接种6只裸鼠,每只接种0.2 mL。体内培养10周后取材。通过对新生组织的大体观察、测量湿重、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色等方法对各组新生软骨进行比较。结果实验组、对照组1与对照组3产生不同组织量的软骨样组织,对照组2形成纤维样组织;实验组平均湿重及糖胺多糖含量达到对照组1的88%以上,对照组3平均湿重低于对照组1的40%;HE染色示实验组、对照组1与对照组3的标本均有软骨陷窝形成,对照组2未见软骨陷窝形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色示实验组、对照组1与对照组3均可见Ⅱ型胶原表达;对照组2未见Ⅱ型胶原表达。结论体内共培养条件下,残耳软骨微环境可有效促进脂肪干细胞向软骨方向分化,残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨具备可行性。

关键词：共培养脂肪干细胞残耳软骨细胞体内

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传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响

组织工程与重建外科杂志 2013年第6期9卷 301-305页

作者：康宁刘霞曹谊林肖苒中国医学科学院整形外科医院研究中心北京市100144

目的：研究传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响。方法分离培养人残耳软骨细胞，将第3-8代细胞分别复合聚羟基乙酸/聚乳酸支架，构建组织工程化软骨；体外培养4周后植入裸鼠体内观察8周。采用组织学染色观察各组标本的软骨形成情... 详细信息

目的：研究传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响。方法分离培养人残耳软骨细胞，将第3-8代细胞分别复合聚羟基乙酸/聚乳酸支架，构建组织工程化软骨；体外培养4周后植入裸鼠体内观察8周。采用组织学染色观察各组标本的软骨形成情况；Real-time PCR检测软骨分化相关基因的表达；生物力学分析新生软骨的弹性模量。结果各代复合物体外培养4周时均不能形成软骨组织，但第3-5代残耳软骨细胞COL 2A1、第3-4代的SOX 9和第3代的DLK 1仍可维持较高的表达水平（P〈0.05）；体内植入8周后，第3-6代复合物均有不同程度的弹性软骨结构形成，并随代次增高而减少，第3-6代复合物的弹性模量明显高于第7、8代。结论残耳软骨细胞传至第4代仍能保持良好的体内软骨形成能力，但扩增传代对残耳软骨细胞软骨表型去分化的影响在第7代后已无法逆转。

关键词：传代残耳软骨细胞组织工程软骨

先天性小耳畸形残耳软骨细胞的体外生物学行为的实验研究

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中国美容整形外科杂志 2010年第9期21卷 553-556页

作者：蔡震潘博林琳蒋海越庄洪兴四川省医学科学院四川省人民医院整形外科四川成都610072 中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院整形七科

目的探讨先天性小耳畸形残耳软骨细胞体外生长的生物学特性。方法取先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织，采用胶原酶消化法获得残耳软骨细胞；体外传代培养及生物学特性研究：细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，Ⅱ型... 详细信息

目的探讨先天性小耳畸形残耳软骨细胞体外生长的生物学特性。方法取先天性小耳畸形患者外耳再造手术中废弃的残耳软骨组织，采用胶原酶消化法获得残耳软骨细胞；体外传代培养及生物学特性研究：细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，Ⅱ型胶原免疫组化鉴定残耳软骨细胞，RT—PCR检测第1～5代残耳软骨细胞的Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达。结果原代和第1-3代残耳软骨细胞生长旺盛，呈多角形，第3代以后细胞体积变大，呈长梭形转化，细胞增殖逐渐减弱；免疫组化检测第2代残耳软骨细胞Ⅱ型胶原表达呈阳性；RT—PCR显示mRNA水平第1～3代软骨细胞Ⅱ型胶原高表达，随传代次数增加表达逐渐减弱，第5代基本消失；第1～3代细胞蛋自多糖呈高表达，第4代以后随传代表达逐渐减弱。结论体外成功分离培养出残耳软骨细胞，第1—3代细胞形态保持稳定．Ⅱ型胶原和蛋白聚糖稳定旱高表达。

关键词：残耳软骨细胞 Ⅱ型胶原蛋白多糖种子细胞软骨组织工程

转化生长因子β1促进生物稳定性聚氨酯支架表面软骨组织生成

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转化生长因子β1促进生物稳定性聚氨酯支架表面软骨组织生成

作者：魏建军北京协和医学院

学位级别：硕士

目的评估以生物稳定性聚氨酯(polyurethane PU)为中心支架,应用转化生长因子β1(TGFβ1)促进支架表面残耳软骨细胞生长,制备软骨组织替代物的可行性。内容实验采用弹性聚氨酯(polyurethane PU)材料作为中心支架;以体外扩增获得的残耳软... 详细信息

目的评估以生物稳定性聚氨酯(polyurethane PU)为中心支架,应用转化生长因子β1(TGFβ1)促进支架表面残耳软骨细胞生长,制备软骨组织替代物的可行性。内容实验采用弹性聚氨酯(polyurethane PU)材料作为中心支架;以体外扩增获得的残耳软骨细胞作种子细胞;以TGFβ1促进软骨组织生长。将细胞-支架复合后,诱导培育形成软骨组织-支架复合物。方法取残耳软骨组织,胶原酶消化法获得软骨细胞,体外传代培养及生物学特性研究。体外实验将第5代软骨细胞接种于支架表面,实验组使用TGFβ1诱导,分别于第1、2、3周取材进行大体观察,组织学和免疫组化检测。应用2x3析因设计处理湿重数值。体内实验实验组使用含有TGFβ1的完全培养基,对照组使用普通完全培养基,体外培养1周后,接种于裸鼠皮下。分别于第4、8、12周取材进行大体观察,组织学,免疫组化,RT-PCR和扫描电镜检查。使用SPSS16.0统计软件处理湿重数值。结果原代和第1-5代残耳软骨细胞生长旺盛。细胞在聚氨酯支架表面形成软骨组织,向支架内迁移并分泌基质。组织学检测显示基质内有糖胺多糖及Ⅱ型胶原形成,RT-PCR检测到各实验组SOX9、RUNX2、Aggrecan、CollagenX基因表达水平均高于所对应的阳性对照组,扫描电镜显示细胞在支架表面及孔隙内生长。统计显示体内实验中实验组和对照组获得的软骨组织湿重具有显著差异。结论残耳软骨细胞能够形成包裹聚氨酯支架的软骨组织层,TGFβ1有促进与聚氨酯支架复合的软骨组织生长的作用。

关键词：残耳软骨细胞聚氨酯支架转化生长因子β1 软骨组织