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N-APP-死亡受体6信号系统在阿尔茨海默病神经元轴突断裂中作用的研究进展

生理科学进展 2010年第6期41卷 449-452页

作者：唐永萍王凯徐海伟第三军医大学学员旅重庆400038 第三军医大学生理学教研室重庆400038

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的主要病理特征是脑内β-淀粉样蛋白沉积(amyloid-βpeptide,Aβ)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NTFs),并伴有局部神经元凋亡和轴突断裂。新近发现淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid procursor protein,APP)的水解产物氨基末端片段(N-APP)可与表达于神经元轴突上的死亡受体-6(death recepter-6,DR-6)结合,以caspase-6依赖的方式引起神经元轴突的变性、崩解,并最终导致神经元的凋亡。本文就N-APP与DR-6结合诱导神经元轴突断裂的分子机制及其在AD发生中的可能作用作一综述。

关键词：阿尔茨海默病死亡受体-6 淀粉样蛋白前体蛋白轴突凋亡

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重组人死亡受体6胞外结构域的制备及与淀粉样前体蛋白N端片段相互作用鉴定

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中国生物工程杂志 2016年第2期36卷 1-6页

作者：牛纯青高香罗金华李伟刘秋萍陈韵刘堰西南大学生命科学学院重庆400715 重庆市生物技术研究所有限责任公司重庆401121

人淀粉样前体蛋白氨基端切割片段(a cleaved amino-terminal fragment of amyloid precursor protein,N-APP)结合死亡受体6(Death receptor-6,DR6),会触发神经元和轴突依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的自我毁灭过程,从而导致阿尔茨... 详细信息

人淀粉样前体蛋白氨基端切割片段(a cleaved amino-terminal fragment of amyloid precursor protein,N-APP)结合死亡受体6(Death receptor-6,DR6),会触发神经元和轴突依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的自我毁灭过程,从而导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生。为了在分子水平上研究N-APP-DR6诱导神经元退化途径,制备大量纯化的重组DR6胞外结构域以及鉴定NAPP和DR6胞外结构域的结合位点是关键。从甲醇毕赤酵母中成功表达并纯化了重组DR6胞外域(aa42-349),得率高达90 mg/L。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,构建谷胱甘肽转移酶-死亡受体6(GST-DR6)(aa42-349)融合蛋白原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21,表达融合蛋白GST-DR6(aa42-349),同时纯化得到DR6的配体NAPP,GST pull-down结果显示DR6与NAPP能够在细胞外发生相互作用。

关键词：阿尔茨海默病死亡受体-6 淀粉样前体蛋白毕赤酵母 GST pull down

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雄激素受体辅助调节因子267-a的相互作用蛋白——死亡受体6的鉴定

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中国科学（C辑） 2004年第2期34卷 165-172页

作者：买铁军汪欣张志文辛殿祺那彦群郭应禄北京大学第一医院泌尿外科北京大学泌尿外科研究所北京100034 北京大学第一医院普外科北京100034 北京大学医学部生理教研室北京100083

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-a(androgenreceptor-associatedcoregulator267-a,ARA267-a)的功能,以含有编码ARA267-a中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒,采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质.在筛选文库的阳性克隆中,经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对,发现死亡受体-6(deathreceptor-6,DR6)是ARA267--PHD-SET的相互作用蛋白之一.通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-a的PHD-SET结构域相结合.DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一,它的胞内区含有死亡结构域,参与细胞凋亡信号的传导.这个研究结果提示:有ARA267-a参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-a和DR6的相互作用而产生交叉联系.

关键词：雄激素受体辅助调节因子267-α 死亡受体-6 酵母双杂交系统鉴定核受体 cDNA 肿瘤坏死因子

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重组人死亡受体6在毕赤酵母中的表达、纯化及与淀粉样前体蛋白相互作用的研究

重组人死亡受体6在毕赤酵母中的表达、纯化及与淀粉样前体蛋白相...

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作者：李伟西南大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种中枢神经系统变性病,起病隐袭,病程呈慢性进行性,是老年痴呆中最常见的一种类型。20世纪中叶以来,随老龄化的加快及AD发病率的增高,AD防治已成为全球关注热点。近年有科学研究发现：淀粉样... 详细信息

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种中枢神经系统变性病,起病隐袭,病程呈慢性进行性,是老年痴呆中最常见的一种类型。20世纪中叶以来,随老龄化的加快及AD发病率的增高,AD防治已成为全球关注热点。近年有科学研究发现：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和死亡受体6（Death receptor-6, DR6）在神经细胞自我毁灭的途径中发挥了作用,并且认为APP可能是DR6的配体,当营养因子缺乏时就会通过特定的凋亡受体传递某些胞外信号从而导致神经退化。DR6表达于人体大多数组织和器官,一些证据表明,DR6的表达在活化和分化过程中被调节。APP的N端片段（NAPP）与DR6之间的作用类似于抗原与抗体之间的相互作用,多种因素调节其对轴突的作用。首先受到的是神经营养因子的调节,因为神经生长因子是神经元存活和生长的重要因素,营养因子的缺乏就将导致神经元的萎缩变性,而基底前脑胆碱能神经元（BF-CN）对于神经营养因子的缺乏则更为敏感,这也是AD发生的主要原因之一。在神经营养因子被剥夺的条件下,触发胞外APP的N端片段被β-分泌酶切割后,脱落并产生了NAPP,并且与神经元和轴突表面的DR6结合,激活了依赖于caspase3和caspase6的信号通路导致神经元胞体和神经元轴突的凋亡。由于NAPP-DR6相互作用机制可以很好的解释AD病症的发展过程中神经元轴突的变性崩解,并且在体内和离体条件下神经营养因子剥夺时均有轴突变性崩解和DR6的表达上调现象,这综合表明了DR6-NAPP相互作用机制可能是导致神经元凋亡和轴突变性的调控机制。因此,探究DR6的功能以及研究NAPP-DR6的相互作用机制提供了一个新的突破口,对探索AD的发病原因、致病病理和对AD治疗药物靶标的定位以及开发新的治疗AD的药物提供了一个新的方向。本研究课题以含有DR6全长cDNA的质粒为扩增模板,PCR扩增DR6（aa42-218/aa42-349）的DNA片段,并与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,经筛选鉴定后构建成功了重组载体pPIC9K-DR6（aa42-218/aa42-349）,重组载体经测序验证后电击导入毕赤酵母表达菌株GS115,得到分别表达DR6不同氨基酸片段的两个酵母重组子菌株。经过表达条件的优化实现了重组蛋白的高效分泌表达,经SDS-PAGE电泳分析,在表达上清中有相对分子量大小约为26kD和43kD的外源蛋白产生,经过Western blot检测证明其为目的蛋白。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,成功构建了pGST-DR6（aa42-349）,还纯化得到DR6的配体NAPP, GST pull-down结果显示两者存在体外相互结合. 本实验成功构建了人DR6（aa42-218/aa42-349）的毕赤酵母真核表达载体并实现了高效分泌表达,初步证明了重组DR6和NAPP的体外相互作用,为下一步研究DR6的生物学功能及APP与DR6的相互作用域及相互作用关键残基奠定了基础。

关键词：死亡受体-6 毕赤酵母分泌表达 pull-down 相互作用

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DR6重组表达载体的构建及NAPP在毕赤酵母中的表达、纯化及其对神经细胞凋亡的初步研究

DR6重组表达载体的构建及NAPP在毕赤酵母中的表达、纯化及其对神...

引用

作者：安婷西南大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种患病率高的神经系统疾病,以严重的高级认知功能和记忆功能障碍为临床特征。死亡受体-6（death receptor-6,DR6）是肿瘤坏死因子超家族中的成员,它是Ⅰ型跨膜受体,全长655个氨基酸,理论... 详细信息

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种患病率高的神经系统疾病,以严重的高级认知功能和记忆功能障碍为临床特征。死亡受体-6（death receptor-6,DR6）是肿瘤坏死因子超家族中的成员,它是Ⅰ型跨膜受体,全长655个氨基酸,理论分子量约为35KDa,在很多肿瘤细胞系中高表达。DR6在N末端有一段公认的信号肽序列（1--41氨基酸）,四个胞外半胱氨酸区域（42---211氨基酸）,在它的胞浆段,包含有一个死亡结构域（428---494氨基酸）。淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）是一种Ⅰ型跨膜蛋白,由巨大的胞外氨基端区,疏水的跨膜区及小段的胞内羧基端区构成。研究表明APP在细胞生长、细胞粘附、突起生长、突触发生、创伤修复等多方面有多种功能。然而,APP精确的生物学功能及其已知衍生物的功能至今仍然不是十分清楚。近来研究发现,APP是DR6的配体,在神经营养因子被剥夺的条件下,触发胞外APP的N端部分片段被β-分泌酶切割脱落产生N-APP （amino-terminal fragment of APP）,与表达于神经元轴突上的DR6结合,以依赖于caspase-3和caspase-6的信号通路引起神经元轴突的变性、崩解,并最终导致神经元的凋亡,引发阿尔茨海默病。神经元和轴突的退化是阿尔茨海默氏症的生物标志。因此,研究DR6、NAPP的功能、结构及其对神经细胞的凋亡作用与机制成为探索阿尔茨海默病病因、病理、定位AD治疗药物靶标、开发新的AD治疗药物的有效途径之一。本研究以含有DR6全长cDNA的质粒为模板,采用PCR方法扩增DR6（aa42-218/aa42-349）的DNA片段,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9K,成功构建重组质粒pPIC9K-DR6（aa42-218/aa42-349）,测序验证后将其电击转化至毕赤酵母菌株GS115,得到分别表达DR6不同氨基酸片段的两个酵母重组子菌株。同时将实验室保存重组质粒pPIC9K-NAPP （aa18-185）电击转化毕赤酵母菌株GS115,经过组氨酸营养缺陷平板筛选及抗G418筛选,得到高拷贝酵母重组转化子。经菌落PCR验证,目的基因NAPP （aa18-185）转入酵母菌中。鉴定酵母转化子的甲醇利用型为Mut+后,经甲醇诱导实现了高效分泌表达,SDS-PAGE电泳显示,表达上清中有分子量大小约为34kD的外源蛋白产生,纯化后Western blot证明其为目的蛋白。为了研究DR6和NAPP在神经细胞中的作用,利用配体对受体作用,还纯化得到DR6的配体NAPP,用NAPP去刺激神经母细胞瘤细胞SHEP-1,看对其生长凋亡的影响。实验利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的NAPP处理培养的SHEP-1细胞的凋亡率。流式细胞检测结果显示NAPP组凋亡指数分别为：处理12h各处理浓度（分别为0,2.5,5,10,20,40μg/ml）细胞凋亡率为（1.91±0.5）%（1.92±0.6）%（2.61±0.5）%（3.21±0.7）%（3.81±0.8）%.;处理24h各处理浓度细胞凋亡率为（4.92±0.4）%（5.66±0.5）%（6.81.±0.6）%（7.57±0.4）%（7.29±0.8）%;处理48h各处理浓度细胞凋亡率为（5.46±0.4）%（6.38±0.1）%（8.08±0.4）%（9.51±0.5）%（8.91±0.6）%,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。Annexin V-FITC/PⅠ法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;NAPP能够诱导SHEP-1细胞过度凋亡,且凋亡率随着NAPP浓度的增加和时间的延长而增加。本实验初步证明了重组的NAPP对SHEP-1神经母细胞瘤细胞有明显的诱导凋亡作用,为下一步研究APP和DR6的生物学功能及结构奠定基础,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础。

关键词：淀粉样前体蛋白氨基端死亡受体-6 毕赤酵母分泌表达凋亡作用神经母细胞瘤细胞

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