检索结果-南通市图书馆

作者：岳芳西南大学

学位级别：硕士

棉花是世界上最重要的天然纤维作物之一;棉花纤维是极度伸长的单细胞,纤维素占棉纤维的90%以上,所以,棉花纤维细胞又是研究细胞伸长与次生壁合成的理想材料。脂代谢在植物生长发育中有重要作用,但脂代谢在纤维细胞伸长和次生壁增厚中的... 详细信息

棉花是世界上最重要的天然纤维作物之一;棉花纤维是极度伸长的单细胞,纤维素占棉纤维的90%以上,所以,棉花纤维细胞又是研究细胞伸长与次生壁合成的理想材料。脂代谢在植物生长发育中有重要作用,但脂代谢在纤维细胞伸长和次生壁增厚中的作用尚未阐明。磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸是植物中相对含量较少、但在细胞的生长发育过程中有着重要作用的两种细胞脂质。磷脂酰肌醇合成酶(PIS)是合成磷脂酰肌醇(PI)的关键酶。前人研究表明磷脂酰肌醇的磷酸化物质参与细胞极性生长、信号传导以及各种生物的和非生物的胁迫等。磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)是合成磷脂酰丝氨酸(PS)的关键酶。拟南芥中AtPSS对花粉发育和花序分生组织的生长有重要作用。为了研究磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸对棉花纤维发育的影响,本研究在纤维中分别上调和抑制GhPIS与GhPSS的表达,通过改变磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸的合成,探究它们对纤维发育的影响。主要研究结果如下:1、GhPIS与GhPSS在纤维发育不同时期的表达特性利用Real-Time PCR分别检测GhPIS与GhPSS在纤维发育不同时期的表达。结果表明,GhPIS在纤维快速伸长期和次生壁合成期均有较高表达,GhPSS在纤维次生壁合成期高表达;暗示GhPIS可能与纤维的伸长和次生壁合成有关,而GhPSS可能主要参与纤维次生壁的合成。2、抑制剂LY294002阻碍纤维伸长用磷脂酰肌醇磷酸化过程中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂LY294002处理0 DPA的胚珠,培养13 d。观察纤维发育的结果表明,LY294002能够明显抑制纤维的伸长,表明磷脂酰肌醇途径所产生的磷肌醇类物质参与了纤维细胞的伸长。3、上调和抑制GhPIS的表达对纤维发育的影响利用纤维特异启动子SCFP控制GhPIS在纤维中的表达,调控PI的合成。通过薄层层析分析转基因植株中PI含量变化,结果显示,纤维特异上调GhPIS可使22 DPA纤维中PI的含量相比野生型略有增加,而胚珠中PI含量无明显变化。抑制GhPIS的表达,纤维中PI的含量降低。纤维品质检测结果表明,上调GhPIS的表达,SCFP::GhPIS转基因棉花的纤维长度与野生型相比有所增加。上述结果表明,GhPIS具有合成磷脂酰肌醇的生物学功能,磷脂酰肌醇途径所产生的磷肌醇类物质对纤维伸长有重要作用。在纤维中上调GhPIS的表达能够促进转基因棉花纤维的伸长。4、上调和抑制GhPSS的表达对纤维次生壁沉积的影响利用GC-MS检测转基因棉花22 DPA纤维中脂肪酸相对含量,结果显示,上调GhPSS的表达,不饱和脂肪酸(18:2和18:3)的含量略有增加;而抑制GhPSS的表达,不饱和脂肪酸(18:2和18:3)的含量降低。此外,抑制GhPSS的表达,与次生壁沉积相关的纤维素合成酶基因GhCESAs的表达降低。推测,抑制GhPSS的表达,干扰了纤维素合成酶基因的表达,进而阻碍了纤维素在次生壁的沉积,转基因棉花的衣分减少、马克隆值降低映证了这一推测。上述结果表明,抑制GhPSS的表达,不饱和脂肪酸的含量降低;同时,次生壁纤维素的合成受到阻碍,转基因棉花的马克隆值降低、衣分减少,推测GhPSS参与纤维次生壁合成的调控。

关键词：磷脂酰肌醇合成酶磷脂酰丝氨酸合成酶纤维素合成酶棉花纤维次生壁合成

苦荞FtNAC16、FtNAC33、FtNAC64基因的克隆、功能及序列变异研究

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苦荞FtNAC16、FtNAC33、FtNAC64基因的克隆、功能及序列变异研究

作者：柯瑾贵州师范大学

学位级别：硕士

苦荞(Fagopyrum tataricum)作为一种重要的药食同源特色作物,起源于我国西南地区,属于蓼科荞麦属双子叶植物。苦荞种子不仅含有丰富的营养物质,还含有丰富的生物活性物质,如黄酮、酚酸、三萜和生物碱等,对人体具有极高的保健作用。近年... 详细信息

苦荞(Fagopyrum tataricum)作为一种重要的药食同源特色作物,起源于我国西南地区,属于蓼科荞麦属双子叶植物。苦荞种子不仅含有丰富的营养物质,还含有丰富的生物活性物质,如黄酮、酚酸、三萜和生物碱等,对人体具有极高的保健作用。近年来,苦荞因其优异的保健作用深受人们喜爱,使其加工业得到快速发展。然而,目前生产上的栽培苦荞均属于厚壳苦荞,其种子被厚且坚韧的果壳包裹,导致苦荞脱壳非常困难。苦荞难脱壳已成为制约其加工产业发展的世界性难题。因此,解析苦荞果壳的细胞、生理和分子合成机制对研究并培育易脱壳的薄壳苦荞具有重要意义。本课题组基于前期转录组数据鉴定到3个可能在苦荞果壳细胞次生壁生物合成中起关键调控作用的NAC转录因子基因Ft Pin G0000381200.01、Ft Pin G0007471500.01和Ft Pin G0002596000.01,分别命名为FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64。本研究在此基础上,利用PCR(reverse transcription,RT-PCR)技术,以常规栽培品种厚壳苦荞‘品苦1号’籽粒为模板,克隆得到基因FtNAC16(Gen Bank ***723785)、FtNAC33(Gen Bank ***070416)和FtNAC64(Gen Bank ***070417)。通过对其转录因子特性和表达分析,以及转基因功能验证,探讨转录因子基因FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64对次生壁生物合成及调控网络相关基因表达的影响,以及在苦荞果壳生长发育过程中细胞次生壁生物合成中的功能及其分子调控机制,为培育高产、优质、适应性强的薄壳苦荞新品种提供优异的基因资源和理论依据。主要研究结果如下:1、利用RT-PCR从常规栽培品种厚壳苦荞‘品苦1号’中成功克隆了FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64,其CDS序列全长分别为1 086 bp、861 bp和1 092 bp,分别编码362个、287个和364个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化树分析表明,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64属于植物NAC转录因子NST亚家族成员。2、构建亚细胞定位载体p BWA(V)HS-FtNAC16-GLosgfp、p BWA(V)HS-FtNAC33-GLosgfp和p BWA(V)HS-FtNAC64-GLosgfp,在烟草下表皮细胞进行瞬时表达,结果表明FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64转录因子均定位于细胞核。3、以构建到pGBKT7载体上的FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64基因为诱饵,和p GADT7质粒共转化至酵母菌株AH109,分析转录激活活性,结果表明FtNAC16不具有转录激活特性,FtNAC33和FtNAC64具有较强的转录激活特性。4、基因共表达分析表明,在种子不同发育时期FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64及下游调控基因(二级调控开关Ft MYB83,三级调控开关Ft MYB103和Ft MYB54)和结构基因(纤维素合成酶Ft CESA4、Ft CESA7和Ft CESA8)共表达。5、12个厚壳苦荞与12个薄壳苦荞次生壁组分(纤维素、木质素和半纤维素)含量分析表明,纤维素和半纤维素含量降低,木质素含量升高,可能是影响薄壳苦荞果壳易碎脱落的原因。6、构建苦荞FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64基因的过表达载体p K7WG2D-FtNAC16、p K7WG2D-FtNAC33和p K7WG2D-FtNAC64,采用农杆菌介导侵染法转化苦荞毛状根,分析转基因毛状根中细胞壁厚度、次生壁组分含量和次生壁生物合成途径相关基因的表达情况。结果表明,过表达FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64转基因毛状根的细胞壁明显加厚,显著提高转基因毛状根中纤维素、木质素和半纤维素的含量,显著提高下游调控基因(Ft MYB54)和结构基因(Ft CESA7、Ft IRX9)等的表达。7、与参考基因组数据比对,20个厚壳苦荞和20个薄壳苦荞的重测序结果表明,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64的上游启动子序列与基因序列均无明显的变异位点。综上所述,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64属于NAC转录因子NST亚家族成员,是三个核定位的转录因子,且FtNAC16不具有转录激活特性,FtNAC33和FtNAC64具有较强转录激活特性,可能通过正向调控次生壁合成网络中相关基因的表达促进苦荞种子果壳中次生壁组分的生物合成。

关键词：苦荞 NAC转录因子基因克隆次生壁合成

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一个新的棉花MYB基因的表达和功能研究

一个新的棉花MYB基因的表达和功能研究

作者：孙翔华中师范大学

学位级别：硕士

棉花（Gossypium hirsutum）是世界上最重要的纤维作物,广泛应用于纺织、造纸、生物燃料和化学工业,棉纤维品质决定了其作为商品的价值。棉纤维也是研究纤维素生物合成和单细胞形态发生的良好的模式系统之一。但是,我们对棉纤维生长发... 详细信息

棉花（Gossypium hirsutum）是世界上最重要的纤维作物,广泛应用于纺织、造纸、生物燃料和化学工业,棉纤维品质决定了其作为商品的价值。棉纤维也是研究纤维素生物合成和单细胞形态发生的良好的模式系统之一。但是,我们对棉纤维生长发育的调控过程仍了解较少,缺乏较为系统的研究。 MYB转录因子是植物中最庞大的转录因子家族之一,尤其是R2R3-MYB转录因子,在拟南芥等植物的多种生理代谢过程中发挥重要调控作用。R2R3-MYB转录因子N端为DNA结合结构域（MYB domain）,而C端是转录激活或抑制结构域。其MYB domain高度保守,而转录激活结构域却灵活多变。大多数被鉴定出的R2R3-MYB转录因子都参与到对植物某些特异的生理过程的调控中,包括：植物初级和次级代谢;细胞的分化和形态建成;生长与发育;植物对环境胁迫的应答等。同样也有许多MYB蛋白参与次生细胞壁生物合成的调控。我们在棉花中分离、鉴定了一个新的MYB类转录因子基因,命名为GhMYB103.分析表明,该基因在棉纤维次生壁合成期优势表达,其编码的蛋白定位于细胞核内,并且具有转录自激活效应。另外GhMYB103蛋白与拟南芥AtMYB103、杨树PtrMYB128、PtrMYB10等次生细胞壁合成相关转录因子有着较高的同源性,所以我们推测GhMYB103可能参与到棉纤维次生壁的合成中。本论文主要研究了GhMYB103基因对拟南芥厚壁细胞次生壁合成的影响,进而推测其在棉纤维发育中的功能。主要结果如下： 1、我们从棉花中分离一个编码MYB转录因子的基因,命名为GhMYB103。该基因ORF全长975bp,编码一个含324个氨基酸的蛋白。该蛋白N端包含一段保守的MYB结构域,其中有两个名为R2、R3的亚结构域,C端是转录激活结构域。序列同源性比对及进化树分析得知,GhMYB103与PtrMYB128、PtrMYB10和AtMYB103均有较高的同源性,分别为66%、66%、51%。 2、实时荧光定量RT-PCR分析表明,GhMYB103基因在处于次生壁合成期的棉纤维中优势表达,并且该基因的表达量在12-20DPA纤维中表达量逐渐升高,说明GhMYB103是受纤维发育阶段调控的。 3、构建了GhMYB103::eGFP融合表达载体,转入拟南芥中,研究GhMYB103蛋白的亚细胞定位。用共聚焦显微镜观察转基因拟南芥的根部细胞,发现绿色荧光均分布于细胞核内,说明GhMYB103蛋白定位于细胞核中。 4、为研究GhMYB103蛋白的自激活效应,将pGBKT7-GhMYB103载体分别转入AH109、Y187酵母菌株,通过报告基因ADE2、LacZ来鉴定该蛋白的自激活作用。AH109阳性菌在SD/-Trp/-Ade培养基中划线,Y187阳性菌进行X-gal显色,转入空载体的酵母用作阴性对照。结果显示,AH109阳性菌能够在SD/-Trp/-Ade培养基的平板上生长,而阴性对照不能生长。Y187阳性菌经X-gal显色变蓝,而阴性对照不变色。这说明GhMYB103是一个转录激活子。 5、利用显性抑制技术,研究了GhMYB103在模式植物拟南芥中的功能。结果表明,GhMYB103显性抑制导致转基因拟南芥基部茎木质部导管细胞塌陷。而在4CL1pro::MYB103转基因拟南芥中,过量表达GHMYB103会导致更多的次生壁沉积于维管束间纤维及其邻近的皮层及韧皮纤维。此外,35S启动子驱动GhMYB103过量表达后,引起维管束间纤维及木纤维等纤维细胞的次生壁增厚。通过对次生壁相关基因的分析发现,PAL1, CesA4, CesA7, CesA8等基因在GhMYB103过量表达转基因拟南芥的茎部表达量上调。这些结果表明,GhMYB103可以影响拟南芥茎部次生壁生物合成。前人研究表明,拟南芥茎木质部导管元件和纤维细胞与棉纤维细胞在次生壁合成上有一定的相似性,从而我们推测GhMYB103基因可能参与棉纤维次生壁合成的过程。

关键词：棉花(Gossypium hirsutum) R2R3-MYB蛋白纤维发育基因表达木质素沉积次生壁合成显性抑制

杨树PLETHORA5基因调控次生壁沉积的分子机制研究

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杨树PLETHORA5基因调控次生壁沉积的分子机制研究

作者：刘帅西南大学

学位级别：硕士

树木的次生发育是木材形成的生物学基础,起始于维管形成层细胞的连续分裂。维管形成层向外侧分化为韧皮部,向内侧分化成木质部。木质部的成熟需经历一系列复杂的细胞学进程,包括细胞膨大、次生细胞壁沉积以及细胞的程序性死亡,最终形成... 详细信息

树木的次生发育是木材形成的生物学基础,起始于维管形成层细胞的连续分裂。维管形成层向外侧分化为韧皮部,向内侧分化成木质部。木质部的成熟需经历一系列复杂的细胞学进程,包括细胞膨大、次生细胞壁沉积以及细胞的程序性死亡,最终形成高度木质化的成熟木质部纤维和导管,即为木材。现有研究认为,由NAC和MYB家族转录因子构成的多级前反馈环是次生细胞壁生物合成调控网络的核心。其中,SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN(SND)/VASCULAR RELATED NAC DOMAIN(VND)转录因子作为一级调控开关,调控下游一系列转录因子及次生壁生物合成相关基因的表达。但是,目前围绕SND/VND上游调控的分子机制仍然是未知的。植物的生长发育广泛依赖于激素的调控,生长素是已知调控木材发育最重要的植物激素之一。杨树次生维管组织形成层区域较高浓度的生长素对维持形成层细胞活性,调节细胞分化等方面具有重要作用。当外施一定浓度生长素时,木质部细胞次生壁沉积会受到明显抑制,但其调控机制仍然是未知的。据文献报道,AP2/ERF转录因子家族的亚支AINTEGUMENTA-LIKE(AIL)/PLETHORA(PLT)转录因子家族,广泛参与调控植物生长发育过程。在模式植物拟南芥根尖发育的研究中已经证明,AIL/PLT转录因子处于生长素信号下游,具有与生长素一致的浓度梯度,对其下游基因的调控作用呈现浓度梯度依赖性。在杨树次生维管组织中,AIL/PLT基因家族成员ANT参与对维管形成层细胞分裂的调控并被认为是维管形成层的标记基因。但该家族成员对木质部发育尤其是次生壁沉积等方面的作用及其调控机制仍未见报道。杨树作为模式植物被广泛应用于树木次生发育的研究中。本研究以毛白杨为实验材料,通过对AIL/PLT家族基因进行基因功能分析,揭示其家族基因PLT5介导生长素信号调控下游SND/VND基因表达进而影响木质部次生细胞壁沉积,进一步完善了生长素精细调控次生发育的调控网络。主要研究结果如下:(1)精确表征生长素在次生维管组织中含量的分布模式通过特异性抗体杂交对生长素在杨树次生维管组织中的含量分布模式进行精细检测。免疫荧光结果显示,生长素在次生维管组织中的形成层中大量累积,并且向两侧呈梯度递减模式。这与已有文献报道一致,暗示生长素在次生发育过程中具有重要调控作用。(2)筛选参与木材发育的AIL/PLT家族基因通过系统进化分析,在杨树中鉴定出13个AIL/PLT家族基因。组织表达分析显示,大多数AIL/PLT家族基因在根中具有较高水平的表达,仅ANT和PLT5在茎中表达量较高。利用Aspwood数据库对AIL/PLT家族基因在杨树次生维管组织中的表达模式进行分析,发现ANT和PLT5在维管形成层中具有较高水平的表达。进一步利用冰冻切片分离了野生型毛白杨次生维管的不同组织,并对各组织中ANT和PLT5的表达水平进行检测,发现PLT5的表达模式与生长素分布高度一致。(3)PLT5在维管形成层高表达,而其编码蛋白可移动至木质部通过构建PLT5启动子连接荧光报告基因(proPLT5-e YFP-TMC)的植物表达载体,经遗传转化后获得转基因杨树,用其表征PLT5在次生维管组织中的转录位置。经共聚焦激光扫描显微镜观察后发现PLT5在维管形成层区域高表达,与生长素高累积区域是一致的。同时利用转基因植株(proPLT5-PLT5-e YFP)观察PLT5蛋白定位,发现其蛋白定位在成熟木质部细胞,与其转录本表达位置存在差异,表明其蛋白可能存在移动。(4)PLT5受生长素信号直接调控构建了proPLT5-GUS的植物表达载体,瞬时转化烟草后进行生长素外源处理。GUS酶活检测结果表明,生长素诱导PLT5启动子对其下游基因的转录。外施生长素对野生型毛白杨进行处理,通过q PCR检测发现PLT5的表达水平显著上调。对内源增加生长素信号的转基因植株(ARF5.1-OE)进行q PCR检测,同样发现PLT5表达量显著上调。Effector-Reporter及Ch IP实验结果证明,PLT5被生长素信号响应因子ARF5直接调控。(5)PLT5参与介导生长素对次生维管组织发育的调控为了解析PLT5对杨树次生维管发育的生物学功能,构建了在维管形成层特异上调PLT5表达的转基因株系(pro WOX4-PLT5)。组织切片观察、间苯三酚染色及扫描电镜结果显示,在该转基因株系中木质部的次生壁沉积受到明显抑制,表明过表达PLT5对次生壁合成具有显著的抑制作用,这与生长素对次生壁合成的调控作用一致。同时发现木质部纤维细胞和导管细胞的发育也受到影响,说明PLT5过表达对木质部细胞发育过程也有调控作用。以上结果说明了PLT5介导了生长素对次生壁合成及次生维管组织发育的调控。(

关键词：生长素次生发育 AIL/PLT SND/VND 次生壁合成

抑制棉花类几丁质酶基因（CTLs）表达促进纤维后期伸长

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抑制棉花类几丁质酶基因（CTLs）表达促进纤维后期伸长

作者：姬胜玫华中农业大学

学位级别：硕士

棉花纤维次生壁合成需要很多基因的参与,类几丁质酶基因(CTL)在次生壁增厚期优势表达,可能就是其中之一。在本实验室早期研究海岛棉纤维发育相关基因表达谱克隆了两个基因,分别命名为GbCTL1和GbCTL2。进一步搜索棉花的EST文库TIGR,分析... 详细信息

棉花纤维次生壁合成需要很多基因的参与,类几丁质酶基因(CTL)在次生壁增厚期优势表达,可能就是其中之一。在本实验室早期研究海岛棉纤维发育相关基因表达谱克隆了两个基因,分别命名为GbCTL1和GbCTL2。进一步搜索棉花的EST文库TIGR,分析发现纤维优势表达的CTL就只有两个成员。Realtime-PCR分析表明CTL1的表达量略高于CTL2,并且到达表达高峰的时间略早于CTL2,这两个基因都在15DPA以后开始表达,之后表达量迅速上升并持续到次生壁合成期结束。在其他的组织中CTLs的表达量很低甚至几乎检测不到。为了验证CTLs在棉花纤维次生壁合成中的功能,分别构建35S超量表达载体和RNAi载体,转化棉花YZ1。通过Southern杂交及表达量分析,筛选出插入低拷贝表达量变化明显的植株进行纤维性状考察。RNAi转基因株系纤维变长,超表达纤维变短,但其他性状如强度、马克隆值等变化不明显。另外GbCTLs的表达量变化对纤维的纤维素含量以及次生壁厚度变化没有影响。为了研究该基因是否调控其他基因的表达,检测了已经发表的次生壁合成相关基因表达量。结果显示：在RNAi转基因株系中与纤维伸长正相关的Expansin的表达量上调,胼胝质降解酶GhGlucl的表达量下调,超量表达植株中的表达量变化则与RNAi植株相反。推测可能RNAi株系中Expansin的上调及GhGlucl降解酶的下调增加了胼胝质含量,从而细胞壁的柔性增加而纤维得以伸长。GbCTLs在纤维发育中的功能及机制还需要进一步研究,但从目前的研究结果可以预见在育种中可以采用降低该基因表达量而增加棉花纤维长度策略。

关键词： CTLs 转基因棉花纤维长度次生壁合成