苦荞FtNAC16、FtNAC33、FtNAC64基因的克隆、功能及序列变异研究

作     者：柯瑾 

作者单位：贵州师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈庆富;李洪有

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：苦荞 NAC转录因子 基因克隆 次生壁合成 

摘      要：苦荞(Fagopyrum tataricum)作为一种重要的药食同源特色作物,起源于我国西南地区,属于蓼科荞麦属双子叶植物。苦荞种子不仅含有丰富的营养物质,还含有丰富的生物活性物质,如黄酮、酚酸、三萜和生物碱等,对人体具有极高的保健作用。近年来,苦荞因其优异的保健作用深受人们喜爱,使其加工业得到快速发展。然而,目前生产上的栽培苦荞均属于厚壳苦荞,其种子被厚且坚韧的果壳包裹,导致苦荞脱壳非常困难。苦荞难脱壳已成为制约其加工产业发展的世界性难题。因此,解析苦荞果壳的细胞、生理和分子合成机制对研究并培育易脱壳的薄壳苦荞具有重要意义。本课题组基于前期转录组数据鉴定到3个可能在苦荞果壳细胞次生壁生物合成中起关键调控作用的NAC转录因子基因Ft Pin G0000381200.01、Ft Pin G0007471500.01和Ft Pin G0002596000.01,分别命名为FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64。本研究在此基础上,利用PCR(reverse transcription,RT-PCR)技术,以常规栽培品种厚壳苦荞‘品苦1号’籽粒为模板,克隆得到基因FtNAC16(Gen Bank ***723785)、FtNAC33(Gen Bank ***070416)和FtNAC64(Gen Bank ***070417)。通过对其转录因子特性和表达分析,以及转基因功能验证,探讨转录因子基因FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64对次生壁生物合成及调控网络相关基因表达的影响,以及在苦荞果壳生长发育过程中细胞次生壁生物合成中的功能及其分子调控机制,为培育高产、优质、适应性强的薄壳苦荞新品种提供优异的基因资源和理论依据。主要研究结果如下: 1、利用RT-PCR从常规栽培品种厚壳苦荞‘品苦1号’中成功克隆了FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64,其CDS序列全长分别为1 086 bp、861 bp和1 092 bp,分别编码362个、287个和364个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化树分析表明,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64属于植物NAC转录因子NST亚家族成员。 2、构建亚细胞定位载体p BWA(V)HS-FtNAC16-GLosgfp、p BWA(V)HS-FtNAC33-GLosgfp和p BWA(V)HS-FtNAC64-GLosgfp,在烟草下表皮细胞进行瞬时表达,结果表明FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64转录因子均定位于细胞核。 3、以构建到pGBKT7载体上的FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64基因为诱饵,和p GADT7质粒共转化至酵母菌株AH109,分析转录激活活性,结果表明FtNAC16不具有转录激活特性,FtNAC33和FtNAC64具有较强的转录激活特性。 4、基因共表达分析表明,在种子不同发育时期FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64及下游调控基因(二级调控开关Ft MYB83,三级调控开关Ft MYB103和Ft MYB54)和结构基因(纤维素合成酶Ft CESA4、Ft CESA7和Ft CESA8)共表达。 5、12个厚壳苦荞与12个薄壳苦荞次生壁组分(纤维素、木质素和半纤维素)含量分析表明,纤维素和半纤维素含量降低,木质素含量升高,可能是影响薄壳苦荞果壳易碎脱落的原因。 6、构建苦荞FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64基因的过表达载体p K7WG2D-FtNAC16、p K7WG2D-FtNAC33和p K7WG2D-FtNAC64,采用农杆菌介导侵染法转化苦荞毛状根,分析转基因毛状根中细胞壁厚度、次生壁组分含量和次生壁生物合成途径相关基因的表达情况。结果表明,过表达FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64转基因毛状根的细胞壁明显加厚,显著提高转基因毛状根中纤维素、木质素和半纤维素的含量,显著提高下游调控基因(Ft MYB54)和结构基因(Ft CESA7、Ft IRX9)等的表达。 7、与参考基因组数据比对,20个厚壳苦荞和20个薄壳苦荞的重测序结果表明,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64的上游启动子序列与基因序列均无明显的变异位点。 综上所述,FtNAC16、FtNAC33和FtNAC64属于NAC转录因子NST亚家族成员,是三个核定位的转录因子,且FtNAC16不具有转录激活特性,FtNAC33和FtNAC64具有较强转录激活特性,可能通过正向调控次生壁合成网络中相关基因的表达促进苦荞种子果壳中次生壁组分的生物合成。