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拟南芥生长素输出载体PIN2内吞分拣基序功能分析

拟南芥生长素输出载体PIN2内吞分拣基序功能分析

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作者：张晨燕浙江师范大学

学位级别：硕士

生长素极性运输是生长素调控植物生长发育和环境响应的独特方式,主要决定于质膜定位的生长素极性输出载体PIN（PIN-FORMED）。PIN的输出活性和极性定位决定生长素的极性流向和浓度梯度。之前的研究暗示,拟南芥PIN极性定位受网格蛋白介... 详细信息

生长素极性运输是生长素调控植物生长发育和环境响应的独特方式,主要决定于质膜定位的生长素极性输出载体PIN（PIN-FORMED）。PIN的输出活性和极性定位决定生长素的极性流向和浓度梯度。之前的研究暗示,拟南芥PIN极性定位受网格蛋白介导的质膜内吞调控,但具体调控机制仍不清楚。已有研究表明,动物细胞质膜蛋白内吞受其自身内吞分拣基序（endocytic sorting motif:如“YxxΦ”和“LL”基序）调控,但植物细胞质膜蛋白是否也具有相似的调控机制目前仍缺乏确切证据。为揭示内吞分拣基序在PIN2极性定位和根尖向地性生长中的生物学功能,基于本实验室前期工作,本研究运用生物信息学、遗传学、细胞生物学、生理生化等研究手段或方法,初步阐明拟南芥PIN2内吞分拣基序在根尖向地性生长中的调控机理。具体研究结果如下:（1）生物信息学分析结果表明,拟南芥质膜定位的PIN蛋白（PIN1、2、3、4和7）含有14个“YxxΦ”和5个“LL”候选内吞分拣基序。通过分子克隆和定点突变技术,以PIN2-GFP为模板,成功构建了 19个PIN2内吞分拣基序突变表达载体（用mPIN2-GFP表示）。（2）利用农杆菌介导的花侵染法,将这19个mPIN2-GFP表达载体导入pin2突变体中,获得T3代纯合株系。遗传学分析结果表明,16个mPIN2-GFP载体（mPIN2-GFP-4至-19）能有效互补pin2根尖向地性缺陷表型,表明这16个突变位点不是PIN2介导根尖向地性的关键位点。相反,有3个突变位点（mPIN2-GFP-1、-2和-3）未能有效互补pin2突变体表型,表明这3个突变位点是PIN2介导根尖向地性的关键调控位点。（3）根尖重力刺激响应分析结果表明,mPIN2-GFP-1和-2根尖生长对重力刺激不敏感,表现出与pin2突变体相似的表型;而mPIN2-GFP-3根尖生长对重力刺激仍有部分响应,进一步证实这3个内吞分拣基序在PIN2介导的根尖向地性生长中具有重要调控功能。（4）细胞生物学分析结果表明,mPIN2-GFP-1和-2的极性定位没有下降反而上升,而mPIN2-GFP-3的极性定位下降,暗示前者可能与PIN2极性输出活性调控相关,而后者可能与PIN2极性定位调控相关。根尖生长素分布分析发现,与pin2突变体相似,mPIN2-GFP-2和-3根尖生长素过量积累。根尖重力刺激实验结果表明,与PIN2-GFP相反,2-h重力刺激未能诱导根尖上下两侧mPIN2-GFP的不对称分布。根据以上遗传学和细胞生物学的分析结果,本研究可得出以下初步结论:内吞分拣基序通过调控PIN2极性定位或输出活性,从而调控PIN2介导的根尖向地性生长。本研究结果为进一步剖析PIN极性定位的分子调控机制和PIN介导的生长素极性运输机制提供新的观点与见解。

关键词：拟南芥生长素内吞分拣基序 PIN2蛋白根尖向地性极性定位

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拟南芥PIN2调控根向地性的功能位点分析

拟南芥PIN2调控根向地性的功能位点分析

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作者：刘静兰州大学

学位级别：硕士

根尖向地性生长是植物根系构型在土层中快速建成的重要保障,有利于植物根系从土层中吸收水、无机盐和养分,从而促进植株地上部分的营养生长和生殖生长,是植物进行土壤固着生活不可或缺的生存适应机制之一。早期的生理学研究已经暗示,重... 详细信息

根尖向地性生长是植物根系构型在土层中快速建成的重要保障,有利于植物根系从土层中吸收水、无机盐和养分,从而促进植株地上部分的营养生长和生殖生长,是植物进行土壤固着生活不可或缺的生存适应机制之一。早期的生理学研究已经暗示,重力诱导的生长素不对称分布是引起根尖向地性弯曲的根本原因,其中生长素输出载体PIN2(PIN-FORMED 2)介导的生长素极性运输在根尖生长素不对称分布建立过程中起着至关重要的调控作用。此外,PIN2蛋白的极性定位和输出活性对生长素极性运输有重要作用。研究表明,PIN2蛋白上许多功能位点如磷酸化位点、泛素化位点和内吞分拣基序等能够直接或间接调控PIN2蛋白的极性定位和活性。因此,深入挖掘PIN2调控根尖向地性的功能位点具有十分重要的生物学意义。为探究PIN2蛋白上未发现的功能位点。本研究利用EMS诱变技术,已获得S141和T146两个氨基酸位点突变的突变体agr375和agr498株系,它们的根尖向地性与pin2突变体相似,均失去向地性反应。随后,利用定点突变技术构建相应点突变转基因株系,运用遗传学和细胞生物学的研究方法,初步阐明了S141和T146两个位点在PIN2介导的根尖向地性生长中的生物学功能及其分子机制。具体研究结果如下:(1)通过EMS诱变,多代繁殖筛选,回交和回补等方法,确定两个PIN2点突变株系agr375和agr498,并通过测序确定点突变分别位于PIN2蛋白的第141位(S突变为N;S141N)和146位(T突变为I;T146I)。(2)利用定点突变技术,以Pro PIN2::PIN2-GFP(简称PIN2-GFP)表达载体为模板,构建Pro PIN2::PIN2-GFP(简称S141A)、Pro PIN2::PIN2-GFP(简称S141D)、Pro PIN2::PIN2-GFP(简称T146A)和Pro PIN2::PIN2-GFP(简称T146D)定点突变表达载体,通过拟南芥花序浸染法,将其导入pin2,并获得稳定遗传株系。遗传学分析表明,S141A和T146A能有效回补pin2突变体表型,而S141D不能回补pin2突变体表型,T146D部分回补pin2突变体表型。此外,S141D的根尖对重力刺激响应不敏感,而T146D能部分响应重力刺激。以上这些结果表明,141和146位点对PIN2介导的根尖向地性生长具有重要的生物学功能。(3)利用生长素反应的分子标记DR5::3×NLS-VENUS分析点突变PIN2-GFP的根尖生长素分布和根尖重力刺激后生长素分布情况。结果表明,S141D和T146D能够影响PIN2介导的生长素极性运输。(4)细胞生物学分析表明,S141D的PIN2极性定位正常,而T146D的PIN2极性分布增强。同时,相比野生型,S141D和T146D的生长素在根尖的积累增加,暗示这两个点突变可能均通过影响PIN2的生长素输出活性调控生长素的极性运输。FRAP实验表明,S141D和T146D均减弱了PIN2在质膜上的迁移。Confocal活细胞成像分析PIN2的内吞速率,发现S141D和T146D增强了SA(内吞抑制剂)对PIN2-GFP内吞的抑制效果。以上结果表明,141和146位点都影响PIN2的内吞。据上述实验结果,本研究初步获得以下结论:PIN2蛋白第五个跨膜区141和146位点的突变通过影响PIN2活性调控生长素的极性运输,从而影响拟南芥根的向地性生长;S141D和T146D能够增强PIN2在质膜上的成簇聚合,从而抑制SA处理后PIN2蛋白的内吞速率。本研究为探究PIN2跨膜区功能位点和影响PIN2生长素输出活性的机制提出了新的观点和见解。

关键词：拟南芥 PIN2 生长素根尖向地性功能位点极性定位成簇内吞

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