拟南芥PIN2调控根向地性的功能位点分析

作     者：刘静 

作者单位：兰州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈玉辉;潘建伟

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：拟南芥 PIN2 生长素 根尖向地性 功能位点 极性定位 成簇 内吞 

摘      要：根尖向地性生长是植物根系构型在土层中快速建成的重要保障,有利于植物根系从土层中吸收水、无机盐和养分,从而促进植株地上部分的营养生长和生殖生长,是植物进行土壤固着生活不可或缺的生存适应机制之一。早期的生理学研究已经暗示,重力诱导的生长素不对称分布是引起根尖向地性弯曲的根本原因,其中生长素输出载体PIN2(PIN-FORMED 2)介导的生长素极性运输在根尖生长素不对称分布建立过程中起着至关重要的调控作用。此外,PIN2蛋白的极性定位和输出活性对生长素极性运输有重要作用。研究表明,PIN2蛋白上许多功能位点如磷酸化位点、泛素化位点和内吞分拣基序等能够直接或间接调控PIN2蛋白的极性定位和活性。因此,深入挖掘PIN2调控根尖向地性的功能位点具有十分重要的生物学意义。为探究PIN2蛋白上未发现的功能位点。本研究利用EMS诱变技术,已获得S141和T146两个氨基酸位点突变的突变体agr375和agr498株系,它们的根尖向地性与pin2突变体相似,均失去向地性反应。随后,利用定点突变技术构建相应点突变转基因株系,运用遗传学和细胞生物学的研究方法,初步阐明了S141和T146两个位点在PIN2介导的根尖向地性生长中的生物学功能及其分子机制。具体研究结果如下:(1)通过EMS诱变,多代繁殖筛选,回交和回补等方法,确定两个PIN2点突变株系agr375和agr498,并通过测序确定点突变分别位于PIN2蛋白的第141位(S突变为N;S141N)和146位(T突变为I;T146I)。(2)利用定点突变技术,以Pro PIN2::PIN2-GFP(简称PIN2-GFP)表达载体为模板,构建Pro PIN2::PIN2-GFP(简称S141A)、Pro PIN2::PIN2-GFP(简称S141D)、Pro PIN2::PIN2-GFP(简称T146A)和Pro PIN2::PIN2-GFP(简称T146D)定点突变表达载体,通过拟南芥花序浸染法,将其导入pin2,并获得稳定遗传株系。遗传学分析表明,S141A和T146A能有效回补pin2突变体表型,而S141D不能回补pin2突变体表型,T146D部分回补pin2突变体表型。此外,S141D的根尖对重力刺激响应不敏感,而T146D能部分响应重力刺激。以上这些结果表明,141和146位点对PIN2介导的根尖向地性生长具有重要的生物学功能。(3)利用生长素反应的分子标记DR5::3×NLS-VENUS分析点突变PIN2-GFP的根尖生长素分布和根尖重力刺激后生长素分布情况。结果表明,S141D和T146D能够影响PIN2介导的生长素极性运输。(4)细胞生物学分析表明,S141D的PIN2极性定位正常,而T146D的PIN2极性分布增强。同时,相比野生型,S141D和T146D的生长素在根尖的积累增加,暗示这两个点突变可能均通过影响PIN2的生长素输出活性调控生长素的极性运输。FRAP实验表明,S141D和T146D均减弱了PIN2在质膜上的迁移。Confocal活细胞成像分析PIN2的内吞速率,发现S141D和T146D增强了SA(内吞抑制剂)对PIN2-GFP内吞的抑制效果。以上结果表明,141和146位点都影响PIN2的内吞。据上述实验结果,本研究初步获得以下结论:PIN2蛋白第五个跨膜区141和146位点的突变通过影响PIN2活性调控生长素的极性运输,从而影响拟南芥根的向地性生长;S141D和T146D能够增强PIN2在质膜上的成簇聚合,从而抑制SA处理后PIN2蛋白的内吞速率。本研究为探究PIN2跨膜区功能位点和影响PIN2生长素输出活性的机制提出了新的观点和见解。