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基于Argonaute的病毒核酸检测技术研究进展

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病毒学报 2023年第5期39卷 1414-1424页

作者：刘妍孙凯田春雨马宁付康俞晓平申屠旭萍中国计量大学生命科学学院、浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

病毒性传染病对人类社会构成严重威胁,特别是近年来由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的冠状病毒肺炎(COVID-19)暴发,引发了全球大流行,严重危害人类生命健康。快速、敏感、便携的病毒鉴定技术对于疾病监测、控制和治疗至关重要。近年来,以c... 详细信息

病毒性传染病对人类社会构成严重威胁,特别是近年来由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的冠状病毒肺炎(COVID-19)暴发,引发了全球大流行,严重危害人类生命健康。快速、敏感、便携的病毒鉴定技术对于疾病监测、控制和治疗至关重要。近年来,以clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)基因编辑系统为代表的新型检测方法因其在核酸识别方面的高灵敏度、特异性和可编程性而被广泛用于分子诊断。然而CRISPR检测技术也面临着诸多挑战,包括protospacer adjacent motif(PAM)对检测序列的限制,以及多重目标检测的困难。Argonaute(Ago)蛋白是一种广泛存在于生物体内的高度保守的蛋白,它可以通过"引导RNA"或"引导DNA"裂解互补链RNA或DNA,且无PAM序列的限制。这种蛋白有望克服CRISPR基因编辑核酸检测技术的缺点,并进一步提高测定的效率。本研究概述了最近关于基于Ago的病毒核酸检测技术,讨论了这些新兴生物传感器的潜在应用及挑战,以期为开发新一代高灵敏度核酸检测平台提供新的思路。

关键词： Argonaute 病毒检测核酸检测核酸酶快速检测

双淬灭TaqMan探针应用于新型冠状病毒核酸检测的初步研究

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病毒学报 2022年第4期38卷 784-790页

作者：伍嘉豪张嫦丽王娴默范文易华伟长江大学附属第一医院荆州434021 长江大学医学部荆州434023

核酸检测是新型冠状病毒肺炎(COVID⁃19)诊断的金标准。目前,临床上主要采用基于TaqMan探针的荧光定量PCR(qPCR)来检测新型冠状病毒(SARS⁃CoV⁃2)的N基因和ORF1a/b序列。在实际的核酸检测中,因采样和qPCR灵敏度问题导致的假阴性结果时有... 详细信息

核酸检测是新型冠状病毒肺炎(COVID⁃19)诊断的金标准。目前,临床上主要采用基于TaqMan探针的荧光定量PCR(qPCR)来检测新型冠状病毒(SARS⁃CoV⁃2)的N基因和ORF1a/b序列。在实际的核酸检测中,因采样和qPCR灵敏度问题导致的假阴性结果时有发生。为了优化SARS⁃CoV⁃2的核酸检测,我们设计了含有两个淬灭基团的双淬灭TaqMan探针,与单淬灭TaqMan探针相比,双淬灭TaqMan探针的背景荧光信号更低(161±9 vs.290±18)。同时,我们以N基因质粒和假病毒作为核酸检测的模板,发现双淬灭TaqMan探针检测体系具有更好的检测精密度(CV 1.4%vs 2.3%;0.6%vs 2.1%)以及更低的检测下限。

关键词：新型冠状病毒核酸检测荧光定量PCR 双淬灭TaqMan探针

基于RAA-CRISPR/Cas12a的鸡毒支原体核酸检测方法的建立

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东北农业大学学报 2023年第10期54卷 28-35页

作者：王剑赵普润崔嘉窈霍乃蕊山西农业大学动物医学学院山西晋中030801

将重组酶介导的扩增技术(RAA)、CRISPR/Cas12a的切割反应及酶标仪或试纸条相结合,建立设备依赖度低的鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)核酸检测方法。以MG基因mgc2为靶标,设计CRISPR RNA及RAA引物,并优化检测体系、评价新建核... 详细信息

将重组酶介导的扩增技术(RAA)、CRISPR/Cas12a的切割反应及酶标仪或试纸条相结合,建立设备依赖度低的鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)核酸检测方法。以MG基因mgc2为靶标,设计CRISPR RNA及RAA引物,并优化检测体系、评价新建核酸检测方法性能。结果表明,该方法特异性和灵敏性均较好,对除MG外其他常见病原体检测结果均为阴性,检测下限可达10 copies·μL^(-1)。与商业化荧光定量PCR试剂盒对比检测45份临床样品符合率超过93%。综上,通过将RAA与CRISPR/Cas12a相结合,建立一种不依赖昂贵仪器的MG核酸检测方法,具有良好应用前景。

关键词：鸡毒支原体 CRISPR RAA 核酸检测

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新冠肺炎方舱核酸检测基地感染防控策略

中国感染控制杂志 2022年第2期21卷 140-146页

作者：周鹏程肖伟田芳芳赵先平马乐龙章迪胡崇宇黄勋吴安华梁英李亚陈媛媛宋巧李春辉中南大学湘雅三医院医院感染控制中心湖南长沙410013 中南大学湘雅医院医院感染控制中心湖南长沙410008 湖南省人民医院湖南省师范大学附属第一医院医务部湖南长沙410021 湖南省卫生健康委员会医政医管处湖南长沙410008 湖南省中医药研究院附属医院消化内科湖南长沙410006 张家界市中医院消化内科湖南张家界427000 湖南省儿童医院医务部湖南长沙410007 中南大学湘雅三医院检验科湖南长沙410013 张家界市人民医院医院感染管理部湖南张家界427000 张家界市爱尔眼科医院院感科湖南张家界427000 张家界市仁康中医院院感科湖南张家界427000

方舱核酸检测基地是实现快速大规模核酸筛查、控制新型冠状病毒肺炎疫情的核心设施,但由于其检测机构众多、人员构成复杂、水平参差不齐,感染防控风险较大。在张家界航空工业职业技术学院核酸检测基地的实践中,工作人员探索出一套完整... 详细信息

方舱核酸检测基地是实现快速大规模核酸筛查、控制新型冠状病毒肺炎疫情的核心设施,但由于其检测机构众多、人员构成复杂、水平参差不齐,感染防控风险较大。在张家界航空工业职业技术学院核酸检测基地的实践中,工作人员探索出一套完整的感染防控方案和流程:基地选址、布局、路径规划,完善感染防控组织架构和制定感染防控制度,人员和路径的管控,工作人员闭环管理、培训、个人防护,核酸检测安全管理,医疗废物的处置,环境物体表面消毒,职业暴露处理,撤离及终末消毒,工作人员医学观察。为基地完成“零漏诊、零感染、零传播”的目标奠定了坚实的基础。

关键词：方舱实验室新型冠状病毒肺炎感染防控生物安全核酸检测

新型冠状病毒监测网络省市级疾控实验室核酸检测室间质评

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疾病监测 2022年第10期37卷 1356-1362页

作者：陆柔剑黄保英赵莉叶飞邓瑶任皎王文阿如罕陈昱达罗美惠王文玲谭文杰中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委生物安全重点实验室北京102206 包头医学院内蒙古包头014040

目的对全国32个省市级疾控机构新冠监测网络实验室新型冠状病毒(新冠病毒)变异株核酸检测能力进行室间质评,同时对常规所用新冠病毒核酸检测试剂性能进行评价。方法制备新冠病毒武汉株及4个关切变异株、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和H3... 详细信息

目的对全国32个省市级疾控机构新冠监测网络实验室新型冠状病毒(新冠病毒)变异株核酸检测能力进行室间质评,同时对常规所用新冠病毒核酸检测试剂性能进行评价。方法制备新冠病毒武汉株及4个关切变异株、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和H3亚型流感病毒(H3N2)核酸样本,发放给全国31个省、自治区及直辖市和新疆生产建设兵团疾病预防控制中心新冠监测网络实验室进行室间质评。每个实验室的考核样本盘包括两种不同Ct值(~35、~30)的新冠病毒武汉株、关切变异株(α和γ或β和δ)、HCoV-OC43、流感病毒核酸样本共10支。根据反馈结果计算检测符合率并对检测结果进行深入分析。同时,收集各考核实验室常用的新冠病毒核酸检测试剂盒进行检测性能验证。结果全国省市级疾控机构新冠监测网络实验室室间质评总体达标率为100%(32/32),总体优秀率72%(23/32);初测中,新冠病毒、HCoV-OC43核酸样本检测总符合率为99.7%(319/320)、89%(57/64)。对32个考核实验室送检的新冠病毒核酸检测试剂盒进行性能验证,66%(33/50)的试剂盒检测限与说明书相符,92%(11/12)的受检试剂盒特异性达标。结论32个省市疾控机构实验室新冠病毒核酸检测能力全部达标,均能检测新冠病毒武汉株及阿尔法、贝塔、伽马和德尔塔变异株;送检的部分核酸检测试剂检测限与说明书不符,检测性能有待改进。

关键词：新型冠状病毒核酸检测室间质量评价性能验证

新型冠状病毒突变株Omicron核酸检测的TaqMan探针设计

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病毒学报 2022年第3期38卷 528-533页

作者：张嫦丽伍嘉豪易华伟长江大学附属第一医院荆州434021

Omicron(奥密克戎)作为最新的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)突变株,其带有大量的突变位点,且突变位点主要位于S蛋白上,这不仅会增加再次感染病毒的风险,同时也会大幅降低疫苗和抗体疗法的的效果。Omicron携带的突变虽不影响国内现使用的核... 详细信息

Omicron(奥密克戎)作为最新的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)突变株,其带有大量的突变位点,且突变位点主要位于S蛋白上,这不仅会增加再次感染病毒的风险,同时也会大幅降低疫苗和抗体疗法的的效果。Omicron携带的突变虽不影响国内现使用的核酸检测试剂,但这些检测试剂不能有效地鉴别出Omicron突变株。本研究通过对Omicron以及其他SARS-CoV-2突变株的基因序列进行分析,设计了能特异性检测Omicron突变株的TaqMan探针。同时,该探针可与现有的核酸检测体系进行结合,实现SARS-CoV-2核酸检测和Omicron突变株鉴别的双重功能。

关键词：新型冠状病毒突变株Omicron 核酸检测 TaqMan探针

基于CRISPR-Cas13a和RT-RAA的HIV核酸检测方法的建立

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中国艾滋病性病 2022年第3期28卷 264-270页

作者：李小辉粟斌寇志华吴昊张彤孙岩松韩尧乔惠丽李浩姜太一南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 首都医科大学附属北京佑安医院感染中心北京100069 军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

目的探索一种基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和反转录重组酶介导的等温扩增(RTRAA)技术HIV核酸检测新方法的可行性。方法在HIV网络数据库***下载HIV CRF07_BC亚型基因序列,根据保守序列设计RT-RAA引物和crRNA。通过荧光法C... 详细信息

目的探索一种基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和反转录重组酶介导的等温扩增(RTRAA)技术HIV核酸检测新方法的可行性。方法在HIV网络数据库***下载HIV CRF07_BC亚型基因序列,根据保守序列设计RT-RAA引物和crRNA。通过荧光法CRISPR核酸检测筛选crRNA;利用梯度稀释的HIV RNA模板评价荧光法和试纸法CRISPR核酸检测的灵敏度;利用6种病原体核酸和不同亚型的HIV临床样本评价该方法的特异性。结果从5条候选的crRNA中筛选出了1条检测灵敏度较高的crRNA;荧光法和试纸法CRISPR核酸检测HIV RNA的灵敏度均为10拷贝/μL,与RT-qPCR法的灵敏度一致。荧光法和试纸法CRISPR核酸检测均可特异性检出HIV CRF07_BC亚型,与其他病原体核酸无明显交叉反应。在20例HIV临床样本检测中,试纸法CRISPR核酸检测准确检出了10例CRF07_BC以及1例B亚型。结论本研究建立了针对HIV CRF07_BC亚型的CRISPR核酸检测方法,具有便携、快速、高灵敏度和特异性的特点,为HIV感染者的检测和抗病毒治疗过程监测提供新的方法。

关键词：艾滋病病毒成簇的规律间隔的短回文重复序列等温扩增 CRF07_BC亚型核酸检测

基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

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中国热带医学 2023年第7期23卷 686-691页

作者：李梦茹秦志强殷堃梁家瑞杨硕郑彬中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际研究中心/上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院上海200025 上海交通大学医学院上海200025

目的建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法。方法以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMPCRISPR反应体系。用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度。用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果。结果建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段。其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA的最佳反应浓度为40 nmol/L,Cas12a蛋白的最佳反应浓度为40 nmol/L。该方法与肝片形吸虫等蠕虫基因组DNA均无交叉反应;以10倍梯度稀释的重组质粒为模板,该方法检测限为10拷贝/μL;此外,该方法能够准确检测出日本血吸虫虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫基因组DNA。45份钉螺样本检测结果显示,LAMP-CRISPR与LAMP检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(χ^(2)=0.05,P>0.05);与金标准比较,LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为96.67%(29/30),LAMP方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为93.33%(28/30)。结论本研究建立了一种灵敏性和特异性均较高的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫核酸检测方法,具有用于日本血吸虫感染快速检测及风险监测的潜力。

关键词：日本血吸虫蠕虫环介导等温扩增规则成簇的间隔短回文重复序列核酸检测钉螺

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病毒核酸检测技术及临床应用

中华实验和临床病毒学杂志 2022年第3期36卷 337-345页

作者：王然张林琳田娇刘梦佳谢正德国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所感染与病毒研究室中国医学科学院儿童危重感染诊治创新单元国家呼吸系统疾病临床医学研究中心儿科重大疾病研究教育部重点实验室儿童呼吸道感染性疾病研究北京重点实验室北京100045

病毒性感染性/传染性疾病是严重影响人类生命健康的一类重大疾病,新发和突发传染病中也以病毒性居多。快速准确的病毒病原检测对于该类疾病的临床诊疗和预防控制具有重要意义。病毒核酸检测作为一种重要的辅助诊断方法,具有灵敏度高和... 详细信息

病毒性感染性/传染性疾病是严重影响人类生命健康的一类重大疾病,新发和突发传染病中也以病毒性居多。快速准确的病毒病原检测对于该类疾病的临床诊疗和预防控制具有重要意义。病毒核酸检测作为一种重要的辅助诊断方法,具有灵敏度高和特异性强等优势,现已成为明确病因、确定治疗方案、评估治疗效果和预后的重要手段。基于聚合酶链式反应、等温扩增技术和基因组测序等一系列方法已成功应用于病毒核酸检测。本文将从目前临床常用的病毒核酸检测方法与应用,以及结果解读中需注意的问题等方面进行讨论,助力病毒性感染性/传染性疾病的精准诊断与治疗。

关键词：病毒核酸检测临床应用