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核糖体工程与原生质体融合选育高产ε-聚赖氨酸菌株

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核糖体工程与原生质体融合选育高产ε-聚赖氨酸菌株

作者：吕世龙南阳师范学院

学位级别：硕士

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由255个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的一种均聚氨基酸,具有抑菌性广、热稳定好以及安全性高等优点,在欧洲中亚等地区作为食品防腐剂和药物载体广泛应用。我国ε-PL研究时间短,未能实现千吨级工... 详细信息

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由255个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的一种均聚氨基酸,具有抑菌性广、热稳定好以及安全性高等优点,在欧洲中亚等地区作为食品防腐剂和药物载体广泛应用。我国ε-PL研究时间短,未能实现千吨级工业化生产,因此选育ε-PL高产菌株,实现低成本、高效率的工业化发酵生产,对我国的食品行业具有极其重要的意义。本研究以ε-PL产生菌S.albulus AM为出发菌株,建立24深孔板培养代替摇瓶发酵筛选体系;通过核糖体工程三轮改造以及原生质体融合技术提高菌株ε-PL合成能力;对高产菌株进行形态学研究、基因分析及发酵性能检测,建立一种有效的育种手段。具体研究内容如下:1.核糖体工程选育ε-PL高产突变株。通过对菌株24深孔板培养和摇瓶发酵数据分析,发现两者间存在显著性(P=0.022体融合选育ε-PL高产融合子。以高Str抗性突变株S-53和高Gen抗性突变株G-154为亲本菌株。S-53的原生质体最佳制备条件为:培养32 h、溶菌酶浓度5 mg/m L、酶解时间90 min、酶解温度32℃;灭活条件为:60℃处理50 min;紫外(20 W,10 cm)照射100 min;G-154的原生质体最佳制备条件为:培养24 h、溶菌酶浓度7 mg/m L、酶解时间120 min、酶解温度32℃;灭活条件为:60℃处理60 min;紫外(20 W,10 cm)照射100 min。促融剂PEG 6000的最适作用浓度为40%。通过“双亲灭活法原生质体融合”和“原生质体融合结合抗性筛选”两种选育手段,共挑选8种不同于原始菌株的菌落形态,并筛选到一株ε-PL摇瓶产量2.51 g/L的高产菌株SG-162,较亲本菌株ε-PL摇瓶产量分别提升了78%和58%,是出发菌株AM的3.58倍。3.高产菌株形态学研究及基因分析。以高产菌株SG-162与AM为研究对象,对比两菌株在菌落形态、孢子生长分化、突变位点及指纹图谱等方面的差异,发现SG-162的菌落形态与出发菌株存在显著不同,且孢子生长速度及孢子化能力减弱;在摇瓶发酵过程中,SG-162能维持致密且均匀的菌丝球形态;SG-162的rps L基因存在位点特异性替换突变,即S12蛋白第34位碱基G突变为T。通过BOX-PCR指纹图谱对比,高产菌株SG-162缺失一段500 bp左右的基因片段。4.高产菌株SG-162发酵性能研究。通过6种发酵培养基中ε-PL含量测定,得出优化培养基为最适培养基,发酵96 h产量达到2.51 g/L;高产菌株SG-162两阶段补料-分批发酵发酵168 h后,ε-PL最终产量达到33.2 g/L,菌体干重41.3 g/L,菌体单位合成能力达到0.8 g/g。

关键词： ε-聚赖氨酸核糖体工程原生质体融合发酵性能

核糖体工程技术选育达托霉素高产菌株及其转录组分析

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核糖体工程技术选育达托霉素高产菌株及其转录组分析

作者：褚帅北南阳师范学院

学位级别：硕士

达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)产生的一种环脂肽类抗生素,在医学上主要用于耐药细菌感染的治疗,但野生菌株的达托霉素产量极低。本研究通过多种抗生素逐级引入的核糖体工程育种技术,并结合ARTP-DES... 详细信息

达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)产生的一种环脂肽类抗生素,在医学上主要用于耐药细菌感染的治疗,但野生菌株的达托霉素产量极低。本研究通过多种抗生素逐级引入的核糖体工程育种技术,并结合ARTP-DES复合诱变,来选育一株遗传性能稳定的达托霉素高产菌株。经5 L发酵罐验证高产菌株的工业化潜力后再通过比较转录组学技术,对突变菌株较出发菌株在转录水平上的差异进行分析,找到与高产达托霉素有关的关键性基因,为进一步探究其高产机制打下基础。研究内容和结果如下:1.核糖体工程技术选育达托霉素高产菌株。通过抗性平板实验筛选出了链霉素、庆大霉素以及利福霉素三种有效抗生素,这三种抗生素对菌株ZC-63的最小抑菌浓度分别为1.4μg/m L、8.0μg/m L、9.0μg/m L。经ARTP-DES复合诱变构建基因突变文库后,使用链霉素进行第一轮核糖体工程改造,改造后的菌株达托霉素产量较原始菌株ZC-63提高了163.8%;使用庆大霉素进行第二轮核糖体工程改造,改造后的菌株达托霉素产量较第一轮核糖体工程改造后又提高了88.3%;使用利福霉素进行第三轮核糖体工程改造,最终获得一株达托霉素摇瓶效价为99.58 mg/L高产菌株RG-904,较第二轮核糖体工程改造后又提高了27.8%。遗传稳定性实验结果表明,高产菌株RG-904高产性能稳定遗传。2.高产菌株的形态学与遗传学研究。将高产菌株RG-904与出发菌株ZC-63进行形态学比较,高产菌株RG-904产生粉白色的色素,菌落形态更为规则,菌丝球菌丝更为松散,孢子产生能力出现一定程度上的下降。对两株菌进行rps L基因比对,高产菌株RG-904的第440位碱基G缺失,导致翻译提前终止。3.高产菌株的5 L发酵罐研究。在发酵过程中温度、p H以及通气量等条件恒定,分阶段向罐内补加前体物质癸酸钠。即发酵前30 h,不补加癸酸钠溶液;发酵30～72 h内,每隔6 h补加25 m L的癸酸钠溶液;72 h后,每隔12 h补加25 m L的癸酸钠溶液。最终菌株RG-904在发酵132 h时,发酵液中达托霉素含量达到最大值,为473.33 mg/L。4.高产菌株RG-904与出发菌株ZC-63的比较转录组学研究。通过对差异表达的基因进行GO、KEGG注释分析,共找到7个可能与高产达托霉素有关的基因,分别为K7395＿RS24500、K7395＿RS27480、K7395＿RS26500、K7395＿RS30220、K7395＿RS27885、K7395＿RS17965和K7395＿RS03680。对这7个基因进行RT-q PCR验证,结果显示这7个差异基因的相对表达量与转录组结果基本一致。

关键词：达托霉素核糖体工程发酵罐转录组学

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核糖体工程技术选育优质菌株的研究进展

发酵科技通讯 2022年第3期51卷 169-175页

作者：陈骁昱吴忧雷佳乐李佳柯孙文艳章华伟浙江工业大学药学院浙江杭州310014

微生物次级代谢产物结构丰富、生物活性多样,是药物先导物的重要来源,然而野生菌株来源的先导物往往有效成分含量低、组分杂,严重影响其产业化应用。核糖体工程是选育优质发酵工业菌株的常用技术,简单高效。综述了国内外利用核糖体工程... 详细信息

微生物次级代谢产物结构丰富、生物活性多样,是药物先导物的重要来源,然而野生菌株来源的先导物往往有效成分含量低、组分杂,严重影响其产业化应用。核糖体工程是选育优质发酵工业菌株的常用技术,简单高效。综述了国内外利用核糖体工程技术选育优质菌株,特别是提高其次级代谢产物合成能力的研究进展,包括单抗生素诱变、多抗生素诱变和复合诱变,为选育其他优质菌株提供参考。

关键词：核糖体工程次级代谢产物合成能力诱变育种

基于核糖体工程定向选育ε-PL高产菌株及发酵条件优化

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基于核糖体工程定向选育ε-PL高产菌株及发酵条件优化

作者：徐祖伟江南大学

学位级别：硕士

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由25～35个L-赖氨酸单体组成的一种天然聚合物,作为一种广谱的抗菌肽在食品、医学、农药等领域有很大的应用潜力。然而,目前利用微生物法生产ε-PL存在生产强度低、发酵周期长、工艺不稳定等问题。因此,如何进一步... 详细信息

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由25～35个L-赖氨酸单体组成的一种天然聚合物,作为一种广谱的抗菌肽在食品、医学、农药等领域有很大的应用潜力。然而,目前利用微生物法生产ε-PL存在生产强度低、发酵周期长、工艺不稳定等问题。因此,如何进一步提高S.albulus的合成能力是目前工业化生产面临的重大挑战。为此,本研究采用了核糖体工程与发酵工程相结合的方法,对白色链霉菌(Streptomyces.albulus)进行了复合诱变及发酵过程的控制与优化,有效的提高了菌株生长性能和ε-PL合成能力,并进一步解析了对核糖体工程的作用机理,其主要的研究内容如下:1.基于核糖体工程筛选高产ε-PL的S.albulus菌株。首先,确定了新的菌种选育策略,即使用微孔板培养技术并结合酶标仪来快速检测产量。其次,以S.albulus FMME-545为出发菌株,通过常温常压等离子诱变(ARTP)结合核糖体工程选育了一株具有利福霉素抗性的高产菌株S.albulus FMME-545RX,其ε-PL产量达到2.44 g/L,相较于出发菌株提升了105%。之后,进行第三轮ARTP诱变将链霉素抗性引入其中,选育出一株“利福霉素+链霉素”双重抗性菌株S.albulus FMME-545RX-S,其ε-PL产量达到了2.88g/L。最后,在5L发酵罐上对其进行补料分批发酵,发酵192 h后ε-PL产量达到33.5g/L,相较于出发菌株提高了50%。2.解析基于核糖体工程的ε-PL高产作用机理。通过对比出发菌株S.albulus FMME-545和突变株S.albulus FMME-545RX-S的菌体生长性能和产物合成能力、菌落形态、转录水平,从这三个方面由表及里的进行分析。首先,通过菌体的比生长曲线和产物的比合成曲线对比分析发现核糖体工程可显著的提高菌体的生长性能和产物的合成能力。其次,从菌落形态的对比分析表明,突变株FMME-545RX-S其孢子成熟的更快,菌丝更为粗壮,形态分化周期更短。最后,从转录水平的差异性对比分析突变株FMME-545RXS其上调基因主要集中在氨基酸代谢、碳代谢和能量代谢这几个模块,对提高菌体的酸耐受能力和增加碳通量至关重要。3.基于发酵条件优化策略提高ε-PL的产量。通过对发酵过程中营养条件与发酵参数的进一步优化,确定了最优的发酵条件为:采用葡萄糖与蔗糖的双碳源发酵策略,发酵过程中最适p H和DO分别为3.80和30%。在此最优条件下,发酵192 h后,ε-PL的产量、生产强度和单位细胞合成能力分别达到了53.0 g/L、6.63 g/(L?d)和0.88 g/g,相比于出发菌株S.albulus FMME-545分别提高了130%、131%和118%。上述研究结果为ε-PL工业化生产提供了有益的借鉴。

关键词： ε-PL 白色链霉菌核糖体工程 ARTP诱变发酵优化机理解析

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微生物核糖体工程研究进展

微生物学报 2009年第8期49卷 981-986页

作者：谢庶洁肖静徐俊国家海洋局生物遗传资源重点实验室第三海洋研究所厦门361005 厦门大学生命科学学院厦门361005

微生物获得特定类型的抗性突变,不仅反映了其核糖体或RNA多聚酶上相关靶位点结构的改变,也对突变菌株次级代谢产物(抗生素等)的生物合成能力产生深刻影响,因此筛选抗性突变株可作为微生物推理选育的途径之一。"核糖体工程"是利用微生物... 详细信息

微生物获得特定类型的抗性突变,不仅反映了其核糖体或RNA多聚酶上相关靶位点结构的改变,也对突变菌株次级代谢产物(抗生素等)的生物合成能力产生深刻影响,因此筛选抗性突变株可作为微生物推理选育的途径之一。"核糖体工程"是利用微生物的各类抗性突变为筛选标记,高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的推理育种新方法。本文综述了微生物"核糖体工程"的概念、各类突变的作用机理,并着重介绍组合抗性突变在提高出发菌株次级代谢产物产量方面的应用。

关键词：核糖体工程抗生素抗性次级代谢微生物育种

利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌

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生物工程学报 2021年第6期37卷 2116-2126页

作者：刘娟娟张妍赫卫清中国医学科学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院药物合成生物学重点实验室北京100050 沈阳同联集团有限公司辽宁沈阳110042

可利霉素(Carrimycin,CAM)是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferase gene,ist)导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成基因簇相距较远,且具有两种抗性基因,难以对其进行基因改造,因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点,将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游,获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2,经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株,以54IA-2为出发菌株,利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin,RFP)抗性菌株,在RFP浓度为40μg/mL的抗性菌株中,ISP的产量明显提高,最高可达842.9μg/mL,比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析,每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸,在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述,本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2,并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8,为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。

关键词：可利霉素 4″-O-异戊酰基转移酶基因 CRISPR-Cas9系统核糖体工程

放线菌Streptomyces sp. FJ3的核糖体工程改良与活性产物的分离

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微生物学报 2011年第7期51卷 934-940页

作者：海乐黄宇琪廖国建胡昌华西南大学药学院重庆400716

【目的】利用核糖体工程抗性筛选技术,获得有抗菌活性突变株,并对突变株新产生活性物质进行研究。【方法】以三峡库区筛选出的无抗菌活性放线菌野生株为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离筛选具有链霉素和利福平抗性突变株;通... 详细信息

【目的】利用核糖体工程抗性筛选技术,获得有抗菌活性突变株,并对突变株新产生活性物质进行研究。【方法】以三峡库区筛选出的无抗菌活性放线菌野生株为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离筛选具有链霉素和利福平抗性突变株;通过摇瓶发酵和对发酵液进行纸片法活性测定,获得抗金葡菌活性突变株;采用高效液相色谱法(HPLC)分析其发酵液组分,通过LC-MS对变化峰进行分析;进行16S rDNA及形态学鉴定。【结果】链霉素和利福平对放线菌菌株FJ3的MIC分别为0.5μg/mL和110μg/mL;在FJ3突变菌株中,共获得24株链霉素突变菌株和20株利福平突变菌株,抗菌活性筛选显示6株具有抗菌活性,其中2株链霉素突变菌株对金葡菌有强抑菌活性,采用Doskochilova溶剂系统纸层析结果表明,该活性物质为一种核酸类抗生素,HPLC和LC-MS显示该活性物质可能为硫藤黄菌素。【结论】利用核糖体工程技术可以改变放线菌的次级代谢,获得具有生物活性的突变株,拓展药源放线菌活性菌株新资源。

关键词：三峡库区放线菌核糖体工程链霉素抗性抗金黄色葡萄球菌活性

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核糖体工程与微生物次级代谢产物合成

生物技术通报 2012年第9期28卷 51-58页

作者：蔡成平王远山郑裕国浙江工业大学生物工程研究所、教育部生物转化与生物净化工程中心杭州310014

核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA聚合酶进行修饰和改造,带来其结构和功能上的改变,进而影响次级代谢产物的合成。因此,向核糖体组成元件中引入特定的突变就能够有效地调节次级代谢产... 详细信息

核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA聚合酶进行修饰和改造,带来其结构和功能上的改变,进而影响次级代谢产物的合成。因此,向核糖体组成元件中引入特定的突变就能够有效地调节次级代谢产物的合成,通过该技术改造有重要商业价值的工业微生物,提高其次级代谢产物(如抗生素)的合成能力,对于微生物次生代谢产物研发及产业化具有重要的科研与经济价值。

关键词：核糖体工程核糖体 RNA聚合酶次级代谢产物

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核糖体工程技术选育阿维拉霉素高产菌株

农业生物技术学报 2019年第7期27卷 1322-1330页

作者：刘华华陈宇航陈敏浙江工商大学食品与生物工程学院

阿维拉霉素是一种新型的代谢调节剂和消化促进剂,被广泛应用于国内外畜禽养殖中。菌种产素能力低、发酵工艺不成熟等因素限制了阿维拉霉素在国内的工业化生产。本研究通过核糖体工程技术,采用链霉素对实验室保藏的绿色产色链霉菌菌株(St... 详细信息

阿维拉霉素是一种新型的代谢调节剂和消化促进剂,被广泛应用于国内外畜禽养殖中。菌种产素能力低、发酵工艺不成熟等因素限制了阿维拉霉素在国内的工业化生产。本研究通过核糖体工程技术,采用链霉素对实验室保藏的绿色产色链霉菌菌株(Streptomyces viridochromogenes gs 77)进行抗性选育,以获得阿维拉霉素高产突变菌株。经过药敏试纸法和高效液相色谱法(HPLC)筛选获得一株阿维拉霉素高产突变菌株S. viridochromogenes gs 77-54,摇瓶第8天时阿维拉霉素产量达到最大,为出发菌株的1.80倍,传代实验表明突变菌株高产性能遗传稳定。对突变前后菌株的形态特征和rpsl基因(编码核糖体蛋白S12)分析,结果显示突变菌株的气生菌丝长直形、较为粗壮,孢子为直径约1.1μm×0.6μm的椭圆形,与出发菌株存在明显区别。rpsl基因序列分析结果发现,该基因片段出现点突变,第356位的G突变为A,由精氨酸突变为谷氨酰胺。本研究筛选到阿维拉霉素高产突变菌株,为绿色产色链霉菌菌种选育提供了新的参考资料。

关键词：阿维拉霉素核糖体工程菌株选育链霉素抗性